经宏基因组二代测序诊断立克次体病3例

张兰，袁兰，袁义美，王震，范雪娟，崔宁，袁春

(中国人民解放军联勤保障部队第九九〇医院 感染科，河南 信阳 464000)

立克次体病是一组由立克次体感染引起的急性传染病，为一类严重威胁人类健康的人畜共患自然疫源性疾病[1]。目前临床上最常用的诊断立克次体病的方法为外斐试验，但特异性较差，且此反应出现较晚，不能做早期诊断，因此诊断价值有限[2-3]。宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)是一种新型的病原学诊断方法，已成为新发、突发、罕见及常规检测阴性的感染性疾病诊断的重要手段。这项技术提高了临床医生对感染性疾病的认识，在中枢神经系统感染、呼吸道感染及血流感染的诊断中体现了价值，成为精准诊疗的重要驱动力[4]。本文通过总结3例经mNGS检测后诊断的立克次体病的临床资料，分析其临床及治疗要点，探讨mNGS在立克次体病早期诊断中的应用价值，旨在提高对立克次体病的诊断和研究水平。

1 对象与方法

1.1 研究对象回顾性分析2020年9月至2021年4月于中国人民解放军联勤保障部队第九九〇医院感染科住院疑诊为立克次体病，最终经mNGS检测技术确诊的3例患者的临床资料。详细记录每例患者的病史、临床表现、体征、实验室检查[白细胞(white blood cell，WBC)、血小板(platelet，PLT)、超敏C反应蛋白(hypersensitive C reactive protein，hs-CRP)、降钙素原(procalcitonin，PCT)、白蛋白(albumin，Alb)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)]、治疗以及血液mNGS检测结果等资料。

1.2 诊断标准立克次体病诊断标准为：(1)流行病学资料，如发病季节、当地流行情况、被蜱虫叮咬史、职业等；(2)临床主要表现为发热、皮疹等；(3)多西环素治疗48～72 h退热；(4)经血液mNGS检测出立克次体，至少2次发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV)核酸阴性，并排除其他病原体所致的感染。

1.3 宏基因组二代测序患者入院后、应用多西环素前，留取EDTA抗凝外周血5 mL，样本获取后立即放入-80 ℃冰箱冻存，保存在干冰中运输至北京博奥医学检验所进行病原菌 mNGS分析。博奥MAPMITM检测基于BioelectronSeq 4000基因测序仪，可覆盖7 374种病毒(涵盖DNA病毒和RNA病毒)、13 362种细菌、1 659种真菌、153种寄生虫及2 500种耐药基因。

2 结果

2.1 一般临床资料3例患者均来自河南信阳，均为女性，职业为农民，年龄为54～74岁，中位年龄66岁。

2.2 流行病学特征3例患者发病时间分别为2020年9月、2020年10月及2021年4月，居住地均为山区丘陵地带，发病前在林区、草丛、茶山等地域有野外活动史。2例有明确蜱叮咬史，另外1例虽然无明确蜱叮咬史，但居住地周围有蜱活动。

2.3 临床表现

2.3.1症状 3例患者均急性发病，以发热为主要表现，第2～3日即达高峰，呈稽留热型，体温39～40 ℃，同时伴有头痛、乏力、纳差、全身肌肉酸痛、关节痛等症状，部分有恶心、呕吐，无腹泻、腹痛、意识障碍、咳嗽、咳痰等症状，无明显皮肤黏膜、腔道器官出血等。见表1。

表1 3例立克次体病患者的临床资料

2.3.2体征 3例患者均有明显皮疹，皮疹出现在发热后3～4 d。早期为粉红色斑疹，直径1～3 mm，皮疹形态不规则，多孤立存在，不融合。进展期为暗红色斑丘疹，直径2～5 mm，按之不消失，皮疹的颜色随着体温升高而加深，体温下降，颜色变浅。恢复期体温正常后皮疹逐渐消退，皮疹可持续2周，常留色素沉着，无脱屑。皮疹多见躯干部，1～2 d内遍及四肢，面部少见，手掌、脚底无皮疹。2例被蜱叮咬的患者在叮咬处出现类似恙虫病样焦痂；1例患者有淋巴结肿大。3例患者均无结膜充血及脑膜刺激征等。早期、进展期、恢复期皮疹及焦痂见图1。

2.4 实验室检查

2.4.1血常规 3例患者中，有1例WBC减少，另2例正常(见图2A)。3例患者PLT均降低，随病情恢复逐渐升高(见图2B)，血红蛋白基本正常。

2.4.2生化检测 3例患者均有不同程度血清Alb降低(见图3A)和LDH升高(见图3B)、hs-CRP升高。2例患者AST、ALT轻度升高，1例CK稍升高，3例患者肾功能均正常。3例患者AST、ALT、CK变化分别见图3C、图3D、图3E。

A为焦痂(病程第4日)；B为腹部早期皮疹(病程第4日)；C为背部进展期皮疹(病程第6日)；D为背部恢复期皮疹(病程第11日)。

图2 患者WBC(A)和PLT(B)变化

图3 患者Alb(A)、LDH(B)、AST(C)、ALT(D)、CK(E)变化

2.4.3病原学检测及影像学检查 3例患者外斐试验、布鲁菌病凝集试验、SFTSV-RNA及血培养均阴性。2例患者行胸腹部CT检查显示胸腔少许积液，未见肺部感染，无肝、脾、纵隔及腹腔淋巴结肿大。

2.5 血液mNGS检测结果以血液mNGS检出病原序列数大于1为条件，共检出细菌3属3种，病毒1属1种(HBV)，立克次体1种(均为Rickettsiaargasii)。检测结果显示存在背景菌，包括不动杆菌、地衣芽孢杆菌、产酸克雷伯菌。排除背景菌序列后，mNGS检测到所有Rickettsiaargasii的核酸序列数为160～1 739，基因覆盖率为1.42%～9.79%。见表1。

2.6 治疗及转归

2.6.1抗生素治疗 所有患者入院后静脉滴注盐酸多西环素200 mg，每日1次，疗程5～7 d。

2.6.2对症支持治疗 患者卧床休息，高热量、优质蛋白、低纤维素饮食，维持水电解质平衡。当血清Alb<30 g·L-1，输注新鲜冰冻血浆或200 g·L-1人血白蛋白注射液。给予肝功能异常的患者甘草酸制剂等保肝、降酶治疗。

2.6.3转归 3例患者静滴多西环素后48 h体温下降，96 h恢复正常，临床症状逐渐改善。经积极治疗，患者均痊愈出院，随访无明显不适，体温变化见图4。

图4 患者体温变化

3 讨论

立克次体病是一类重要的人畜共患疾病，在全世界范围流行，其病原体在自然界动物宿主与传播媒介(蜱、螨、蚤等)中维持循环，这些传播媒介的地理分布及活动季节决定了人类的发病地区与时间。除了传统立克次体病如斑疹伤寒、斑点热、恙虫病、Q热等在我国流行外，近年来大量研究和流行病学资料显示，我国存在多种新发蜱传立克次体病，如西伯利亚立克次体、虎林立克次体、雷氏立克次体、黑龙江立克次体、蒙纳克立克次体等十余种斑点热种群立克次体(spotted fever group rickettsia, SFGR)[5]。已证实至少有17种SFGR对人体有致病性，其中8种为新发现的立克次体[5]。河南信阳为发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)的主要疫源地，该病主要经蜱传播。在823例SFTS确诊病例回顾性研究中发现，复合感染SFGR约占8.5%，而且在河南信阳首次检测到雷氏立克次体、日本立克次体2种SFGR，并发现1种新型的SFGR，暂命名为信阳立克次体[6]。

随着对新发感染病的重视和研究的不断深入，尤其mNGS迅速发展，改变了传统病原学诊断模式。mNGS能快速鉴定新发病原体，检测罕见病原体、跨物种传播病原体、混合感染病原体和培养阴性的细菌/真菌性病原体[7]。3例患者具有发热、皮疹、头痛立克次体病典型三联征表现，SFTSV等病原体检测阴性，多西环素治疗效果良好，结合流行病学史，符合立克次体病表现。3例患者经mNGS检测出的序列可以证明这种新型立克次体可引起临床疾病。需要进一步加强研究，尤其针对该立克次体的分离培养。

蜱作为传播媒介可引起病毒性疾病、螺旋体病、立克次体病等多种虫媒传染病。SFTS和Rickettsiaargasii感染引起的立克次体病在流行病学特征(农民多发、4～10月发病、蜱叮咬史、户外作业史)、临床表现(急性发热为主要表现)、实验室检查(WBC、PLT、血清Alb降低，ALT、AST、CK、LDH升高)等方面具有相似的表现，临床鉴别诊断相对困难，容易误诊。SFTS病例病情进展更快，纳差、恶心、呕吐、腹泻等消化道症状更加突出，腹股沟等浅表淋巴结肿大、疼痛的可能性更高(可高达70%以上)，WBC、PLT下降幅度及ALT、AST、CK、LDH升高幅度更大，但无皮疹，少焦痂，病死率高达10%～30%，SFTSV-RNA阳性可确诊[8-9]。躯干、四肢散在淡红色斑丘疹且部分伴有焦痂是立克次体病患者早期主要的阳性体征。掌握以上特点有利于基层医生及早诊断疑似病例，及时将患者转至有确诊条件的医疗机构，最大可能减少误诊和降低病死率。本研究中的3例患者均因发热、血小板减少在当地医院怀疑SFTS而转诊，入院时查体即发现皮疹，拟诊立克次体病，及时行外周血mNGS检测。美国疾病控制与预防中心在蜱传立克次体病的诊疗原则中强调，对高度怀疑立克次体病时，及时采用四环素类药物进行经验治疗，无须等实验室检测结果。延迟治疗可导致疾病加重甚至死亡。患者高热在24～48 h得到缓解对诊断有重要意义，如发热不退，则可基本排除立克次体病[10]。根据以上诊疗原则，3例患者在入院当日即经验性给予多西环素抗感染治疗，争取了早期的治疗时机。

蜱传立克次体病作为新发蜱媒传染病，逐渐引起世界的广泛关注。许多具有致病性的立克次体已被确定为人类致病病原体，并且一些立克次体已被国际反恐列为生物恐怖主义病原体。本研究通过mNGS首次证明Rickettsiaargasii这一新型立克次体的致病作用，并详细描写其临床表现、实验室化验指标异常变化、治疗等，为今后新发立克次体病的研究提供借鉴。