基于高通量分子对接技术筛选干预COVID-19的潜在活性分子及中药

祁建宏，董芳旭，王 轲，刘子铭，朱锦璐

(1.山东中医药大学 药学院，济南 250355；2.山东中医药大学 外国语学院，济南 250355；3.山东中医药大学 中医药创新研究院，济南 250355)

目前，SARS-CoV-2已经蔓延到全球100多个国家和地区，许多国家面临疫情的二次暴发。现在仍然缺少针对该病毒的特效药物，抗病毒药物亟待研发，主要的药物研究策略包括老药新用、广谱抗病毒药物的重定位以及分子靶向药物的开发[1]。ACE2已被证实是SARS-CoV和SARS-CoV-2的受体[2]，且SARS-CoV-2与ACE2的结合能力比SARS-CoV与ACE2的结合能力更强[3]，如此高的结合能力证实了SARS-CoV-2的高传染性。3CL pro又称主蛋白酶(Mpro)，是复制新冠病毒所必需的酶，它可能在切割病毒多聚蛋白，促进SARS-CoV-2复制及干扰宿主抗病毒天然免疫反应等方面发挥重要作用[4]。AXL起源于古希腊语“anexelekto”，意思是“过度的，无法控制的”[5]。20世纪80年代，AXL被首次从慢性粒细胞白血病(CML)患者中分离和检测出来[6]。AXL是一种受体酪氨酸激酶，属于肿瘤相关巨噬细胞家族，可在上皮、间充质和造血细胞系中广泛表达。它可以通过与生长停滞特异性蛋白6(Gas6)结合激活酪氨酸激酶，从而激活下游信号转导途径，如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途径、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径、蛋白激酶C(PKC)途径、核因子-κB(NF-κB)途径等[7-8]。然而，异常的AXL信号转导将导致炎症、自身免疫性疾病和癌症[9]。近年来，AXL在多种肿瘤中的高表达备受关注。相关研究表明，AXL参与肿瘤细胞的迁移、增殖和侵袭，与肿瘤细胞的耐药机制密切相关[8,10]。目前，已有批准上市的AXL抑制剂药物，表明AXL已成为一个重要的药物靶点[11]。

目前，抗COVID-19靶向药物的研究主要集中在ACE2和3CL pro，靶点数量相对较少，难以发挥协同抗病毒作用。值得注意的是，2021年由Cell Research报道的AXL是抗COVID-19的新型潜在宿主靶标，并表现出良好的抗病毒活性[12]。研究者认为ACE2主要在人体肾脏和消化系统中表达，但表达量很低，难以支持SARS-CoV-2的高传染性理论，因此推测可能存在其他重要受体。研究者通过SARS-CoV-2感染实验和计算生物学实验分析，结果表明，AXL可能是一种不同于ACE2的新型受体，几乎可以在所有类型的呼吸细胞中高表达。此外，作为一种重要的跨膜蛋白，AXL介导着SARS-CoV-2在呼吸道细胞中的吸附和内化。本研究基于AXL、ACE2和3CL pro筛选COVID-19的潜在活性分子(PAM)，并预测潜在中药，为抗COVID-19药物的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 小分子数据库的建立

本研究基于TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)[13]数据库筛选了COVID-19的潜在活性小分子，该数据库是世界上最大的中药非商业分子数据库之一。本实验将TCMSP数据库中的13 020个小分子作为研究对象，通过python脚本[14]下载所有小分子的MOL2格式文件，建立用于分子对接的小分子数据库。

1.2 共同靶标PAM的初步筛选

本研究采用计算机辅助药物设计，实现抗COVID-19靶点与小分子数据库的高通量分子对接。首先，以AXL为主要靶点，通过AutoDock Vina[15]和python脚本对小分子数据库中的化合物进行虚拟筛选，保留结合能力优于原配体的PAM-Ⅰ。然后，以ACE2和3CL pro为标志性靶点，分别筛选PAM-Ⅰ中的化合物PAM-Ⅱ和PAM-Ⅲ。基于分子共靶标原理，取PAM-Ⅱ和PAM-Ⅲ的交集，通过Jvenn (http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/index.html)[16]平台进行可视化，从而得到共靶标PAM。此外，根据化合物的结构对其进行分类，进一步探讨抗COVID-19药物与化合物结构母核的相关性。

1.3 共靶标PAM的成药性研究

基于ADME(吸收、分布、代谢、排泄)和Lipinski规则的评价是成药性研究的重要步骤[17]。这些方法可以帮助研究人员筛除不合格的化合物，从而节省人力、财力和物力，提高药物研发效率。在临床前的药物研究中，OB>30%和DL>0.18常作为药物ADME评价的重要标准[18-19]，而Mw<500、clogP<5和Hdon<5常作为Lipinski规则的筛选标准[20]。

1.4 临床治疗药物的分子对接实验

目前，虽然没有针对COVID-19的特效药，但一些常规抗病毒药物在临床上显示出良好的治疗效果。为了验证实验方法的可靠性和实验结果的可行性，笔者检索并收集了已上市且应用于临床的COVID-19治疗药物，评估这3个靶点与临床药物的结合能力。

1.5 潜在中药的预测

通过TCMSP、TCMIP(http://www.tcmip.cn/TCMIP/)[21]、TCMID(http://119.3.41.228∶8000/tcmid/)[22]等数据库搜集包含PAM的所有中药。基于统计学方法和抗病毒活性原则，筛选出治疗COVID-19的潜在中药。

2 结果

2.1 共同靶标PAM的初步筛选

本研究使用AutoDock Vina和python脚本进行高通量分子对接，并使用PyMol软件将对接结果可视化。对于靶点AXL(PDB ID : 5U6B，分辨率：2.84 Å)[23]，以原配体为中心设置对接盒子参数，中心坐标为(24.436, -13.101, 17.081)，AXL与原配体之间的最佳结合能为-9.2 kcal/mol。一般认为，结合能越小，两个分子的结合力越强。此外，结合能低于-5 kcal/mol则认为两个分子具有较强的结合能力[24]。AXL与TCMSP数据库对接结果显示，139个PAM-Ⅰ不仅低于原配体的结合能，而且低于-5 kcal/mol，其中Chelidimerine与AXL的结合能力最强：-12.6 kcal/mol，如图1a)。2020年，Wang等获得了ACE2与RBD结合的复合物晶体结构(PDB ID:6M0J,分辨率：2.45 Å)，并进一步解析出了结合位点，为新药研发提供极大的帮助[2]。根据ACE2-RBD的结合位点，将对接盒子的中心坐标设为(-34.667，27.827，-1.149)。ACE2与139 PAM-Ⅰ的对接结果显示，61个PAM-Ⅱ均低于中位数(-6.9 kcal/mol)，其中C-curarine与ACE2的结合能力最强：-8.4 kcal/mol，如图1b)。对于3CL pro(PDB ID：6LU7,分辨率：2.16 Å)[25]，以原配体为中心设置对接盒子，中心坐标设置为(-9.768, 11.436, 68.904)，3CL pro与原配体之间的最佳结合能为-7.8 kcal/mol。3CL pro与139 PAM-Ⅰ的对接结果表明，103个PAM-Ⅲ不仅低于原配体的结合能而且低于-5 kcal/mol，Chelidimerine与3CL pro的结合能力最强：-10.8 kcal/mol，如图1c)。此外，PAM-Ⅰ、PAM-Ⅱ和PAM-Ⅲ的均方根偏差(RMSD)值均小于2 nm，表明对接体系稳定[20]。

由于化合物可以同时作用于多个不同的靶点，协同发挥特定的生物学功能，即分子共靶标原则。如图1d)所示，有47个共靶点小分子作用于AXL、3CL pro和ACE2。此外，根据其结构分为萜类、生物碱类、黄酮类、醌类、苷类和其他，其中萜类化合物在PAM中所占比例最高，如图1e)。

2.2 Chelidimerine治疗COVID-19的可行性研究

由图1可知，Chelidimerine与AXL和3CL pro的结合能力最强。此外，Chelidimerine的9种构象与ACE2具有良好的结合能力。如今，ACE2与RBD的主要结合位点已被证实，可将其作为Chelidimerine治疗COVID-19可行性研究的重要依据。

首先，Chelidimerine与ACE2的结合分数小于-5 kcal/mol，并且Chelidimerine位于ACE2-RBD的结合位点处(图2)，发挥一定的生物效应和空间位阻效应。如表1所示，Chelidimerine与ACE2的成键类型主要是氢键、疏水作用和静电力，表明它们具有较强的亲和力。此外，成键类型、键长、局部活性位点等具体信息如图3所示。目前，据相关文献报道，Chelidimerine是白屈菜的主要活性成分之一，而白屈菜具有一定的抗呼吸道病毒活性[26]。因此，Chelidimerine很可能是一种尚未报道的治疗COVID-19的化合物。

图1 共靶标PAM的分子对接模式及分类Fig. 1 Molecular Docking and Classification of Co-targeting PAM

图2 Chelidimerine与ACE2-RBD复合物对接整体图Fig. 2 Overall Diagram of Chelidimerine Docking with ACE2-RBD Complex注：a) ～ i)：ACE2-RBD复合物中Chelidimerine的构象分布，其中ACE2-RBD的结合位点处以红色圈出。粉色：ACE2，黄色：RBD，绿色：Chelidimerine的9种构象。

图3 Chelidimerine与ACE2对接局部图Fig. 3 Partial Diagram of Chelidimerine Docking with ACE2注：a) ～ i)：Chelidimerine与ACE2对接的9种构象的成键信息；3种主要作用力：氢键(绿色)、疏水作用(紫色)和静电作用力(橙色)；颜色越深，亲和力越强；键长越短，成键越容易。

2.3 共靶标PAM的成药性研究

首先，基于ADME筛选出15个具有良好口服生物利用度和类药性的化合物；然后，进一步采用Lipinski规则对其进行评价，最终得到10个具有良好药动学特征的化合物(表2)，为后续实验研究提供理论依据。

2.4 临床治疗药物的分子对接实验

通过文献挖掘的方法，收集治疗COVID-19的临床推荐药物，分别为Arbidol、Chloroquine、Lopinavir、Remdesivir和Ritonavir。分子对接结果显示，它们与AXL、ACE2和3CLpro均具有良好的结合能力(表3)。此外，靶点与原配体/中位数、临床药物和PAM的平均结合能分别为-8.0 kcal/mol、-6.6 kcal/mol和-8.4 kcal/mol。因此，配体与受体的结合能力强弱排序为：PAM>原配体/中位数>临床药物，表明PAM与COVID-19的药物靶点具有良好的结合能力。

2.5 潜在中药的预测

通过TCMSP、TCMIP和TCMID数据库检索含有PAM的47种中药，其中高频中药有13种：木香、洋金花、浙贝母、板蓝根、大青叶、青黛、白屈菜、苦地丁、桑叶、桑枝、延胡索、桑白皮和甘草。其中，11种被报道具有抗病毒活性：桑白皮[27]、洋金花[28]、浙贝母[29]、板蓝根[30]、大青叶[31]、青黛[32]、白屈菜[26]、苦地丁[33]、桑叶[34]、桑枝[35]和甘草[36]。值得关注的是，它们都有一定的抗呼吸道病毒的活性。

表1 Chelidimerine与ACE2对接的9种构象参数Table 1 Specific Parameters on Nine Conformations of Chelidimerine Docking with ACE2

表2 共靶标PAM的成药性参数Table 2 Druggability Parameters of Co-target PAM

表2(续)

表3 配体-受体结合能力比较Table 3 Comparison of Ligand-receptor Binding Ability kcal/mol

3 讨论

基于ACE2和3CL pro的研究已成为抗COVID-19药物研发的主流，越来越多的研究证明它们在SARS-CoV-2的入侵和复制环节中发挥重要作用[37-38]。此外，一些新靶点的出现为COVID-19的治疗带来了新的希望。Wang等证明AXL作为抗肿瘤靶点，也是支持SARS-CoV-2高传染性理论的关键蛋白[12]。因此，AXL被认为是SARS-CoV-2的新靶点，研究人员可以通过寻找其抑制剂来阻止病毒入侵宿主细胞。在这项研究中，笔者基于上述3个靶点对中药小分子数据库进行筛选并预测潜在中药，为后续的活性验证实验奠定了科学基础。

本研究在获得的10个成药性良好的化合物中，发现Withanolide D和Oxysanguinarine具有抗病毒活性。2005年，Withanolide D被报道可以抑制SARS冠状病毒的生命周期[39]；此外，Khanal和Patel等通过虚拟对接发现它与SARS-CoV-2相关蛋白具有较强的结合能力，认为它可能具有抗COVID-19活性[40-41]。还有研究者通过计算机模拟分析，初步确定从药用植物(蛇床子草、苦地丁草、桑叶、桑枝)中提取的Oxysanguinarine对登革病毒(DENV)的复制具有潜在的抑制作用，可作为一种新型的潜在抗病毒抑制剂用于后续的体内外实验分析[13,42]。

Chelidimerine作为PAM中与靶标蛋白有最强亲和力的潜在活性小分子，值得进一步研究。本文基于分子对接技术探讨了该化合物抗COVID-19的可行性，认为其可能具有抗COVID-19活性。但Chelidimerine具有分子量大(>500)、口服生物利用度低(<30%)、类药性差(<0.18)等特点，需要对其进行结构修饰与改造。此外，其毒性研究也不容忽视。

本研究中采用3个已知靶点(AXL、ACE2和3CL pro)筛选PAM和预测潜在中药。然而，以下问题仍然需要重点关注：首先，虽然原配体和PAM具有相同的作用中心，但生物学功能可能截然不同；第二，如果PAM是一种抑制剂，被抑制的靶点对机体的器官和功能是否有不良反应尚不清楚；第三，与SARS-CoV-2造成的危害相比，不良反应是否可以接受。总之，本实验所获得的针对COVID-19的PAM和潜在中药可能为后续的抗病毒活性研究、新药研发和临床应用提供有意义的参考。