电子烟油和毛发中合成大麻素CUMYL-PEGACLONE 的检测

焦台风，李亚庆，康刚，陈深树，程良红

广东南天司法鉴定所，广东 深圳 518003

近几年，我国禁毒部门持续推进专项行动，加之疫情影响，我国呈现吸毒人数减少、规模化制毒活动减少、国内缴毒总量减少的积极变化，冰毒、海洛因、氯胺酮等3 类主流毒品滥用治理成效显现。吸毒者为寻求替代品满足毒瘾，交叉滥用非惯用毒品形势日趋严峻[1-3]，其中以合成大麻素为代表的新精神活性物质（new psychoactive substance，NPS）是这类非惯用毒品的典型代替物。合成大麻素类物质是一类人工合成物质，具有与四氢大麻酚（△9-tetrahydrocan⁃nabinol，△9-THC）类似的生理、药理作用和激动大麻素受体的能力，吸食后能产生和传统大麻同样甚至更强烈的欣快感[4-6]，由于合成大麻素类物质成本更低，更易获取，现已成为NPS 中涵盖物质种类最多、滥用最为严重的家族。

自2021 年7 月1 日我国将合成大麻素类物质整类列管以来，市面上贩卖和吸食含有合成大麻素电子烟油的情况虽有好转但仍屡见不鲜。国内已报道合成大麻素的检测方法主要有傅里叶变换红外光谱法（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）[7]、气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[8]、液相色谱-质谱联用法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[9]和超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（ultra-high performance liquid chromatography series quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLCQTOF-MS）[10]等，对新出现的合成大麻素则大多是经制备液相分离后综合采用FTIR、GC-MS、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）等多技术联合进行结构剖析[11-12]。合成大麻素类NPS 的鉴定是当前法医毒物实验室工作的重要需求，5-戊基-2-（2-苯基丙-2-基）-2,5-二氢-1H-吡啶[4，3-b]吲哚-1-酮（5-pentyl-2-（2-phenylpropan-2-yl）-2,5-dihydro-1Hpyrido[4,3-b] indol-1-one，CUMYL-PEGACLONE）属于吲哚类新型合成大麻素，是一种大麻素受体强效激动剂[13-14]，本研究旨在建立联合高效液相色谱-串联质谱法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）和GC-MS 快速测定毛发和电子烟油中合成大麻素 CUMYLPEGACLONE 的方法，并应用于实际案例。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1290 Infinity II 液相色谱-6470 三重四极杆液质联用系统（美国Agilent 公司），7890B 气相色谱-5977B MSD 系统（美国Agilent 公司），Ultra PFPP 液相色谱柱（100 mm×2.1 mm，5 μm；美国Restek 公司），J&W GC 柱（DB-5MS；30 m×0.25 mm，0.25 μm；美国Agilent 公司），Milli-Q®Integral 系统（美国Millipore公司），MS-Hunter 工作站（美国Agilent 公司），AUW220D 型分析天平（日本Shimadzu 公司），Centri⁃fuge 5430 高速离心机（德国Eppendorf 公司），KQ-250DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），P1000L 移液器、P200L 移液器、P20L 移液器（美国Gilson 公司），JXMF-12 型毛发研磨粉碎仪[雷萌生物科技（上海）有限公司]，Nonsterile 13 mm Millex®微孔滤膜（0.22 μm，美国Millipore 公司）。

CUMYL-PEGACLONE（5-戊基-2-（2-苯基丙-2-基）-2，5-二氢-1H-吡啶[4，3-b]吲哚-1-酮）标准对照品（上海原思标物科技有限公司），甲氧那明标准对照品（中国食品药品检定研究院），甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck 公司），蚁酸、乙酸铵（色谱纯，北京百灵威科技有限公司），丙酮（分析纯，广州化学试剂），实验用水为Milli-Q®Integral 系统制得的超纯水。

1.2 检测方法

1.2.1 GC-MS

色谱条件：J&W GC柱；初始温度60 ℃，以15 ℃/min升温至310 ℃，保持15 min；载气He；柱流量1 mL/min；分流比为20∶1；进样量1 μL。

质谱条件：电子轰击（electron impact，EI）离子源，电子能量为70 eV；进样口温度280 ℃；离子源温度230 ℃；全扫描模式，m/z40～500。

1.2.2 HPLC-MS/MS

色谱条件：Ultra PFPP液相色谱柱；室温；流动相A为乙腈，B 为20 mmol/L 乙酸铵和0.1%蚁酸缓冲液；流动相洗脱梯度程序为0～1 min，5%B；1～2 min，20%B；2～3 min，5%B；流速350 μL/min，进样量5 μL。

质谱条件：电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI）正离子模式，检测方式为多反应监测（multiple re⁃action monitoring，MRM）模式，加热气流速10 L/min，离子源电压5 500 V，接口温度300 ℃，碰撞气、气帘气、雾化气及辅助气均为高纯氮气。优化CUMYLPEGACLONE 的MRM 参 数，取1 μg/mL 的CUMYLPEGACLONE 标准溶液直接进样进行母离子扫描，获取其母离子，将母离子进行碰撞诱导解离分析得到二级全扫描质谱特征子离子，选取丰度最大的子离子后，使用MS-Hunter 工作站自动完成MRM 参数的优化。

采用MS-Hunter 工作站采集数据和控制系统。

1.3 检材及其前处理

对深圳市公安局某禁毒大队抓获的15 例涉毒嫌疑人毛发及缴获的含合成大麻素电子烟油约70 g进行检测。空白毛发采自本实验室工作人员（男性，32 岁，无吸毒史），空白电子烟油来自深圳市某办案机关送检的电子烟油（未检出毒品成分）。

毛发检材：毛发检材依次用适量的超纯水和丙酮振荡清洗2次，晾干后剪成长1～2 mm，置冷冻研磨仪中粉碎，准确称取毛发粉末20 mg（±0.1 mg），加入1 mL 内标甲氧那明标准工作液（1 ng/mL），冰水浴超声15 min，离心后取上清液于60 ℃水浴氮吹吹干，残留物用100 μL甲醇复溶，供HPLC-MS/MS分析。

电子烟油检材：称取电子烟油约10 mg，置于15 mL一次性微量离心管中，加入10 mL甲醇，旋涡混匀15 s，超声萃取20 min，冷却至室温，高速离心后上清液通过Nonsterile 13 mm Millex®微孔滤膜，用甲醇稀释后，转移1 mL 至样品瓶，供GC-MS 和HPLC-MS/MS分析。

1.4 方法学验证

1.4.1 线性、检出限和定量限

分别称取20 mg 空白毛发和10 mg 电子烟油添加CUMYL-PEGACLONE 标准溶液，配制成2、4、8、16、30 和50 ng/mL 的加标样品，使用HPLC-MS/MS 分析，根据CUMYL-PEGACLONE 的保留时间和碎片离子定性，以色谱峰面积进行定量，以3 倍信噪比（signalnoise，S/N）对应的质量浓度作为方法的检出限（limit of detection，LOD），以S/N=10 作为方法的定量限（limit of quantitation，LOQ）。以CUMYL-PEGACLONE 的色谱峰峰面积（y）对进样质量浓度（x，ng/mL）进行回归计算，绘制对应基质匹配校准曲线。

1.4.2 精密度和准确度

按毛发和电子烟油基质中CUMYL-PEGACLONE的线性范围选取包括LOQ 在内的低、中、高3个水平的标准添加样品，分别取毛发基质0.02、0.04、0.25 ng/mg（对应上机质量浓度4、8、50 ng/mL），电子烟油基质2、8、50 ng/mL，按优化后的实验条件，每个添加水平做6 次平行实验，连续测定5 d，考察日内精密度、日间精密度及准确度。

1.4.3 基质效应和提取回收率

基质效应（matrix effect，ME）是液相色谱-质谱法分析时存在的一个非常明显的现象，是由于样品基质、样品前处理过程、色谱分离效果、流动相和离子化等因素造成的离子增强或抑制效应，从而影响目标物的定量检测。基质效应的公式ME=(Km/Ks-1)×100中，ME 是空白基质匹配校准曲线的斜率（Km）与纯溶剂标准曲线的斜率（Ks）之差，与纯溶剂标准曲线的斜率之比值，当|ME|小于20%时为弱基质效应，当|ME|为20%～50%时为中等基质效应，当|ME|大于50%时为强基质效应[15]。分别在毛发和电子烟油基质中选取包括LOQ 在内的3 个浓度的标准添加样品，按1.3节方法处理后采用HPLC-MS/MS 测得的峰面积（S1），对应的空白基质样品按照1.3 节处理后加入相应浓度的标准溶液用HPLC-MS/MS 测得的峰面积（S2），以S1/S2计算提取回收率。

2 结果与讨论

2.1 GC-MS 检测结果

使用GC-MS 分析电子烟油，总离子流图见图1，保留时间15 min 之前出峰明显，7890B 气相色谱-5977B MSD 系统自带的美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）谱库检索结果为乙二醇、丙三醇和不同聚合度的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG），推断可能是烟油中的基质；在保留时间为17.75 min 处出现可疑色谱峰（图2），特征离子碎片为m/z91、179、197、254和372，7890B 气相色谱-5977B MSD 系统自带的NIST 谱库检索无匹配结果。经《新精神活性物质分析手册：质谱分册》[16]中质谱分析谱库检索与质谱特征推测，电子烟油中可能含有CUMYL-PEGACLONE（图3），在EI 离子源轰击下，CUMYL-PEGACLONE 可能的裂解途径见图4，质谱图中的基峰m/z254 可能是由CUMYL-PEGACLONE 分子离子结构中与吡啶环上N 原子连接的C-N 键断裂形成，同时生成m/z119 的苯基丙基碎片离子；碎片离子m/z254 进一步丢失戊基碎片形成碎片离子m/z197，m/z119 碎片离子丢失C2H4+形成碎片离子m/z91。将质谱图与CUMYL-PEGACLONE 标准品进行对比，保留时间和特征离子碎片离子丰度均一致。

图1 电子烟油检材的GC-MS 总离子流图Fig.1 GC-MS total ion flow diagram of electronic cigarette oil

图2 保留时间为17.75 min 的可疑色谱峰Fig.2 The suspicious chromatographic peak with retention time of 17.75 min

图3 CUMYL-PEGACLONE 的GC-MS 及化学结构图Fig.3 GC-MS and chemical structure of CUMYLPEGACLONE

图4 EI源下CUMYL-PEGACLONE 的主要碎裂途径Fig.4 The main cleavage pathways of CUMYLPEGACLONE under EI ion source

2.2 HPLC-MS/MS 检测结果

进样体积是高效液相色谱柱产生溶剂效应的重要影响因素，为尽量减少溶剂效应保证定性和定量结果的准确性，本研究对进样体积进行优化，结果（图5）表明，选用4种进样体积均可以实现有效分离，目标物色谱峰未出现向前迁移或色谱峰分叉现象，综合考虑响应和峰形，最终选取的进样体积为5 μL。对CUMYLPEGACLONE的MRM参数进行优化，结果表明，一级离子扫描得到母离子m/z373.2，将m/z373.2进行碰撞诱导得到二级全扫描质谱特征子离子，选取离子丰度相对较大的m/z255.1、m/z185.0、m/z119.0 和m/z91.0子离子与m/z373.2组成MRM离子对，通过MS-Hunter工作站优化得到的碰撞能量分别为8、48、28和50 V，去簇电压均为105 V、加速电压均为4 V。

图5 不同进样体积下的色谱图Fig.5 Chromatogram acquired using different injection volumes

2.3 方法学验证

2.3.1 线性、检出限和定量限

CUMYL-PEGACLONE 在空白基质、毛发基质和电子烟油基质中2～50 ng/mL 与色谱峰峰面积呈良好的线性关系，线性相关系数r均大于0.99，毛发中CUMYL-PEGACLONE 的方法检出限为0.01 ng/mg，定量限为0.02 ng/mg；电子烟油中CUMYL-PEGACLONE的方法检出限为1 ng/mg，定量限为2 ng/mg（表1）。

表1 不同基质中CUMYL-PEGACLONE 的线性范围、线性方程、检出限和定量限Tab.1 Linear ranges，linear equations，limits of detection and limit of quantitation of CUMYL-PEGACLONE in different matrices

2.3.2 基质效应、回收率、精密度和准确度

CUMYL-PEGACLONE 在毛发基质中的基质效应值为-33.8%，存在中等强度离子抑制现象，而电子烟油基质中的基质效应值为5.8%，为基质增强效应。据文献[17]报道，在毛发基质中合成大麻素存在离子抑制现象，且目标物的基质效应受浓度影响较大，浓度越低越容易受到离子抑制影响。CUMYLPEGACLONE 在毛发中含量较低且毛发基质相对复杂导致出现离子抑制现象，而在电子烟油中，基质大多为乙二醇、丙三醇和聚乙二醇等相对单一的小分子，在同等离子化效率下，受基质效应影响较小。

CUMYL-PEGACLONE 在不同基质中的回收率和精密度见表2。在各自的加标浓度下，毛发基质中CUMYL-PEGACLONE的提取回收率为98.2%～132.4%，日内精密度为1.2%～12.9%，连续测定5 d 日间精密度为1.3%～6.1%；电子烟油基质中提取回收率为93.5%～110.6%，日内精密度为0.8%～1.5%，日间精密度0.7%～2.9%，准确度和精密度满足法医毒物测定要求。

表2 CUMYL-PEGACLONE 的回收率、精密度、准确度和基质效应Tab.2 Recovery，precision，accuracy and matrix effect of CUMYL-PEGACLONE （%）

2.4 案例应用

经检测，送检的15 名涉毒人员毛发中均检出CUMYL-PEGACLONE（表3），除1人低于定量限，另14人毛发中CUMYL-PEGACLONE 质量分数为0.035～0.563 ng/mg；2 份电子烟油中CUMYL-PEGACLONE 的质量分数分别为0.17%和0.21%。

表3 15 名涉毒人员年龄、性别和毛发中CUMYL-PEGACLONE 含量Tab.3 Age，gender and the content of CUMYL-PEGACLONG in hair of 15 suspects

3 结论

本研究以涉毒专案中查获人员的毛发和电子烟油为例，在前期没有标准品的情况下利用GC-MS 在EI 源轰击下生成的碎片离子进行裂解途径推导，结合文献资料锁定目标物，后期使用标准物质进一步确证，建立了联合HPLC-MS/MS 和GC-MS 鉴定电子烟油和毛发中合成大麻素CUMYL-PEGACLONE 的方法，为办案机关快速侦办涉毒专案提供了有力证据支撑，亦可为今后涉及此类物质的鉴定提供参考。