植物精油的抑菌机理及对细菌群体感应系统的研究进展

◆作者：聂振昌 陶正国 陆豫 邱声祥 余勃 赵丽云

◆单位：广州立达尔生物科技有限公司

植物精油是从天然植物中萃取出来的一种芳香性的物质，是植物的次生代谢产物，具有不溶于水，易溶于极性少的有机溶剂，分子量小，稳定性差，挥发性强，并具有一定的生物活性等特点。植物精油在香料产业、医疗应用、农业病害防治等方面都有广泛的研究与应用。最近几年抗生素在畜牧业被管理得越来越严格，植物精油作为一类功能性的添加剂被研究得越来越多，尤其在抑菌、抗氧化、抗炎、维护动物肠道健康等方面研究。而在抑菌性的机理研究上，大多数停留在如何控制细菌繁殖的机理研究，普遍认为植物精油通过破坏细菌细胞膜的结构完整性，从而增加细胞膜的通透性，使细胞内的物质流失，最终导致细胞萎缩或者破裂而死亡，或者通过与细胞内的蛋白质、核酸等大分子物质结合，从而使其丧失功能而导致细胞死亡。

群体感应是在不同细菌间或者细菌与宿主之间，细菌为争夺有限的资源，通过破坏一种依赖于群体感应的细菌可以使另一种细菌获得生存优势；如果能够破坏细菌之间的交流，对于防治依赖于群体感应调节其致病性的细菌是十分有效的，对于这样的机制称为群体淬灭，作为一种新型的抑制病害的方式，不是通过杀菌来抑制病原菌，而是通过抑制细菌的致病因子来削弱其致病力（刘鹏等，2007）。因此，对细菌的群体感应系统及其抑制机制的研究越来越受到人们的重视，本文从植物精油的常见抑菌机理研究、细菌的群体感应的介绍及植物精油干扰群体感应系统的机理3方面进行回顾与阐述总结。

1 植物精油抑菌效果及机理

植物精油具有绿色天然、无药物残留、无抗药性等特点，抗生素在畜牧业上的应用受到越来越多的限制，植物精油在抑菌抗菌上的作用受到人们越来越多的重视，从而掀起了利用植物精油代替抗生素的研究与应用热潮。根据相关的研究，植物精油确实具有不俗的抑菌及替抗效果。如吴克刚等（2017）对8种植物精油对肠道常见微生物体外抑菌效果做了相关研究，发现植物精油对7种肠道微生物均有一定程度的抑菌作用，最低抑菌浓度基本在125～3000μL/L，其综合抑杀菌能力最好的是醛类的肉桂油和酚类的牛至油，最低抑菌浓度在125～500μL/L。魏磊等（2016）研究发现在质量浓度0.391～25.000 mg/mL时，12种市售植物精油（罗勒油、大蒜油、山苍子油、蓝桉油、安息香油、柠檬草油、丁香油、百里香油、牛至油、肉桂醛、香芹酚和百里香酚）对3种鸡源常见致病菌（大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌和金黄色葡萄球菌）具有不同程度的抑制作用。汪中兴等（2014）也研究了3种饲用精油（肉桂油、牛至油和百里香油）及其主要成分对猪源致病菌大肠杆菌K88和沙门菌A72的抑菌作用，其中肉桂油及肉桂醛的最低抑菌浓度（MIC）最低，为400～800μL/L；百里香油及百里香酚的作用次之，MIC为1600μL/L；牛至油及香芹酚的作用最差，MIC为1 600～3200μL/L。而 徐 静 等（2021）通过研究市售较多的肉桂醛、香芹酚、百里香酚、丁香酚、桉叶素对大肠杆菌的抑菌效果、得出肉桂醛、香芹酚，百里香酚抑菌效果最好，MIC均在0.64～1.28mg/mL。

对于植物精油的抑菌原理，Martin等（1988）研究表明，香叶醇可以通过降低磷脂细胞的活性，抑制微生物细胞膜的疏水性。罗曼等（2006）通过透射电镜对黄曲霉细胞进行观察，发现柠檬醛使线粒体DNA复制系统发生损伤，受柠檬醛损伤后的线粒体形态会发生畸变。张彬等（2015）对肉桂醛的抑菌机理研究发现，肉桂醛对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的MIC为0.25μL/L，而通过电镜检查发现大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的菌体细胞大量坍陷，细胞膜表面不平整，随着肉桂醛浓度的增大，菌体出现溶胀、扭曲、凹陷，形态遭到严重破坏，同时对菌液检测发现了大量的蛋白质及核酸物质；而谢强等（2014）在研究香芹酚对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞膜的影响中，同样观察到香芹酚对这些细菌细胞膜的完整性、通透性及细胞内物质相类似的影响。通过这些研究，说明肉桂醛与香芹酚等植物精油的醛酚类成分通过对菌体细胞膜产生了破坏性的影响，通过膜电位的检测也发现肉桂醛减低了细胞膜电位，影响了菌体的代谢。以上研究系统地阐述了植物精油的抑菌机理，即可分别通过破坏细菌细胞形态，影响细胞膜完整性及通透性，使胞内物质流失，影响胞内功能物质如蛋白质或核酸的功能发挥；同时减低膜电位，影响新陈代谢活性等，最终导致细菌死亡。

目前，植物精油对致病菌的抑菌作用及机制都有了相关的研究与探讨，主要研究对细菌数量的抑制作用，而对细菌的致病或者毒性作用的机制研究不多，而细菌的群体感应效应反映了细菌与细菌间通过信息交流分泌对宿主有害的物质来保护自己，从而发挥其对宿主的侵害，因此，研究植物精油对细菌的群体感应的抑制作用，对补充植物精油对细菌致病机理具有深刻的意义。

2 细菌的群体感应

所谓群体感应（QS）就是一种细菌细胞与细胞间的通讯系统，当细菌种群密度达到一定阈值时，能够向环境中释放特定的信号分子，从而表现出单一细胞无法完成的一系列生理功能与行为，进而使细菌能更好地适应生存环境，如毒素的分泌、生物发光、生物被膜的形成等（Turan NB等，2017）。20世纪70年代，Hasting等（1979）对费氏弧菌（Vibrio fischeri）和哈维氏弧菌（Vibrio harceyi）的发光机制进行研究，发现了细菌细胞间存在着细菌群体感应，后来细菌群体感应受到了科研工作者越来越多的关注，直到1994年，Fuqua等根据费氏弧菌、哈维氏弧菌、铜绿假单胞菌（PA）等的密度依赖现象，正式将这种细菌间的通讯机制命名为QS，目前的研究已经证明细菌的多种行为是受到群体感应的调控，如细菌的运动性、生物膜的形成、毒力因子的分泌、生物发光、抗生素的产生等（Miller M B等，2008），之后的研究中也陆续发现群体感应系统在各种细菌中是普遍存在的。随着研究越来越深入，相关研究阐明了群体感应过程包括信号分子的产生、信号分子在介质中积累到阈值浓度、受体识别信号分子、根据信号-受体复合体的浓度进行一系列的基因表达这4个阶段（Adonizio A L等，2006）。

3 信号分子

根据相关报道，发现信号分子具有较低的分子量，根据信号分子的种类和机制，将细菌群体感应系统分为以下几个类型：①自体诱导剂酰基高丝氨酸内 酯（Acyl-homoserine,AHLs），这种类型常见于革兰氏阴性菌；②寡肽类（Autoinducing peptides,AIPs）类，常见于革兰氏阳性菌；③呋喃硼酸二酯自身诱导物-2（Auto-inducer,AI-2）类，为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有；④其它信号分子，如喹诺酮（PQS）、AI-3、羟基-棕榈酸甲酯（PAME）等（LEE J等，2015）。至于细菌通过何种方式对这些信号分子进行调控，根据对相关模式菌如铜绿假单胞菌的研究发现，至少包含了3种群体感应系统，分别为las、rhl、pqs系统，并呈现出级联调控的特点。

4 群体感应淬灭

随着群体感应作用效应和信号分子作用机制的研究深入，人们设想通过群体淬灭入手，即通过破坏细菌之间的信息交流，从而控制细菌生物膜的形成与毒力因子的表达(刘鹏等，2007)。如Davies等（1998）研究发现没有合成信号分子能力的铜绿假单胞菌形成的生物膜与母株所形成的生物膜相比，生物膜比较松散，而且对十二烷基钠的抵抗性大大减低。因此群体感应的抑制机制与群体感应抑制剂（QSI）的研究具有很大的研究价值，并发现了一些自然或人工合成的物质对细菌群体感应具有抑制作用，其抑制的方式主要有降低转录调节蛋白的活性、抑制信号分子的合成、降解信号分子等（齐枝花等，2005）。相关的研究发现，QSI轻微抑制或者不抑制细菌的生长繁殖，不会给细菌产生耐药性提供有利的选择压力，因此，有望成为弥补传统抗生素的一种新型抗菌药物。

5 群体感应抑制剂-植物精油

植物在微生物长期进化过程中，进化出一些抑制细菌群体感应的机制，产生的QSI可以控制病原细菌，为激活自身免疫防御争取时间（Zhang L H等，2003）。植物精油来自天然植物，具有绿色环保、安全无毒、广泛的抗菌活性、分子量小以及高抗群体感应等特性，因此植物精油具有成为一种天然理想的QSI的潜力（曾桃花等，2021）。

根据相关报道，植物精油抑制细菌群体感应的方式主要有3种:①利用信号分子类似物，与信号分子竞争受体结合蛋白位点，使下游基因无法被激活；②利用信号分子合成底物类似物或者抑制信号分子合成酶活性，使信号分子合成酶无法或者错误的合成信号分子，从而抑制了群体感应毒力因子；③降解信号分子。信号分子数量在阈值以下，就不会和转录受体蛋白结合，从而无法激活下游毒力因子表达（Ping C C,等，2007；王立燕等，2015；施宇等，2021）。

根据吴红等（2003）报道，当细菌数达到107数量级时候，所产生的信号分子浓度就会达到阈值，大约在10nmol/L，这时候细菌间就产生群体感应。因此，通过各种手段来降低信号分子的浓度，就可以实现对细菌群体效应的抑制作用。有研究发现，葡萄柚精油的主要成分萜烯类化合物d-柠檬烯减少了信号分子AHL的产量，并抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成，减弱了弹性蛋白酶的活性（Luciardi M C等，2020）。而王一鸣等（2019）研究也发现，丁香酚在亚抑菌浓度1μg/mL可以使猪源肺炎克雷伯菌的LuxS基因和mrkD基因表达下调，pfs、IsrR、IsrK基因表达下调，从而达到抑制信号分子AI-2的合成以及其在胞内转运，抑制了肺炎克雷伯菌的黏附作用，虽然不影响细菌生长速度，但减弱了生物膜的形成与毒力的发挥。

细菌生物膜是细菌为了适应外界恶劣环境，维持自身生命，为自身生长繁殖提供屏障而形成的一种生物保护膜，胞外多糖是这种生物膜基质的重要组成成分，可以延缓抗生素的渗透，从而使病原体对抗菌药物产生耐药性（Yildiz F H等，2009）。因此，群体感应抑制剂可以通过减少或者抑制这种膜的产生，这种方法不同于抑菌或者杀菌，而是通过抑制目标菌生物膜的形成，因此不容易产生抗性菌株。而QSI就是在不影响细菌生长的情况下，通过抑制细菌的群体感应机制而达到降低细菌的毒力作用（周丽曼，2013）。如綦国红等（2017）研究发现肉桂醛在非抑菌浓度40μg/mL也可以抑制紫色杆菌CV026产生紫色素的能力，抑制率达到31.53%，同时也抑制了荧光假单胞菌生物膜的形成，使生物膜结构松散，明显减低了细胞密度与团块，对生物膜的抑制率也达到了44.22%，有效地降低了细菌对外界恶劣环境的应变能力。靳盼盼（2019）研究也发现，在不影响细菌生长的条件下，1/4MIC的香芹酚和百里香酚均能显著减低肠道及原料肉腐败菌阴沟肠杆菌和粪肠球菌生物膜胞外多糖含量，抑制细菌的泳动能力，降低了生物膜厚度，导致其结构松散。如施宇等（2021）对迷迭香精油紫色杆菌群体感应抑制试验中，在10‰的迷迭香在不影响细菌生长的情况下，使紫色杆菌的紫色杆菌素含量减少了85%，对生物膜的抑制率达到44%,对已经形成生物膜的清除率接近60%，明显降低了信号分子（AHLs）的含量，推断迷迭香精油可能通过抑制信号分子合成酶活性，虽然需要进一步验证，但总体效果表明了迷迭香精油在亚抑菌浓度下对紫色杆菌的群体感应系统所调控的致病因子产生了抑制作用。

6 展望

近年来对QS及QSI机制的研究越来越受到科研工作者的关注，希望能找到合适的细菌QSI，根据目前研究来看，已经有相当一部分植物性物质可作为QSI，植物精油作为植物的次级代谢产物，其成分天然、安全可靠，在畜牧业当前替抗的背景下，更加让人们认识到植物精油对有害细菌的作用不仅仅停留在抑菌杀菌层面上，还是在不影响致病菌的生长繁殖下，通过对细菌生物膜与毒素的产生等致病因素的抑制作用，也能够减低或者解除细菌的有害作用，使细菌群体感应系统成为防治细菌病害的新标靶，这对植物精油抑制细菌对动物宿主的侵害理论的认识有了进一步更深层次的认识，作为植物精油抑菌理论的有力补充，对植物精油添加剂的替抗研究及应用具有积极的促进作用。虽然植物精油具有成为理想群体感应抑制剂的潜力，且多种精油都有不错的群体感应抑制活性，但抑制机制还不太清晰，因此探清植物精油的群体感应作用机制，大批量筛选具有群体感应抑制活性的植物活性化合物是亟待解决的问题。相信在不远的将来，更多符合生产实际需求的天然、无毒、绿色的植物精油群体感应抑制剂将会研究开发出来，在养殖生产中发挥重要的作用。