胶体金免疫层析技术及其在畜禽疫病诊断中的应用

荣 光，徐向东,2，彭维祺，孙卫平，夏万良，张润峰

（1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南海口 571101；2.湖北师范大学，湖北黄石 435000）

胶体金免疫层析技术（Colloidal gold immunochromatographic assay，GICA)是建立在胶体金、免疫层析、单克隆抗体、新材料、乳胶凝集试验、酶联免疫吸附试验等方法基础之上发展起来的一种新型固相免疫标记检测技术[1]。该技术诞生于20 世纪90 年代初[2]，经过30 多年的不断发展，该技术在生物医药学、植物检疫、食品安全检测、农牧业、重金属残留检测以及动物疫病诊断等各大领域被广泛应用[3,4]。与其他技术领域相比，GICA 在动物疫病诊断方面应用起步较晚，却发展迅速，已经成为当前动物疫病诊断中最简单、快速、敏感的检测技术之一。因该技术具有快速简便、特异性强、成本低、结果判断直观等优点，适合广大基层技术人员大批量检测和普查等，具有巨大的潜力和广阔的前景[5]。本文就GICA 的原理、特点、分类及在动物疫病诊断中的应用进行综述。

1 胶体金免疫层析技术

1.1 胶体金免疫层析技术的原理

胶体金免疫层析技术是一种以胶体金为示踪标志物检测特定抗原或抗体的一种新型的固相免疫标记检测技术。它的原理是以硝酸纤维素膜（NC)作为固相载体，将标记了胶体金的抗原或抗体固定在硝酸纤维素膜（NC)上。检测时，在样品垫上加入待测样品，样品通过毛细作用沿层析方向向前移动。当待测样品中的待测物泳动至胶体金结合垫，与胶体金结合垫上的受体（抗原或抗体)发生特异性结合而形成免疫复合物，层析过程中免疫复合物被富集或截留在检测线，短时间内（5～10min)，可通过胶体金的颜色反应目测得到试验结果[6-8]。

1.2 胶体金免疫层析技术的特点

胶体金免疫层析技术在诊断技术中能够快速发展的主要原因是其具有以下特点。

1.2.1 生产成本低

试纸组成结构简单，生产中使用的设备及耗材成本低，相对易于制造和进行批量生产[9]。

1.2.2 操作简单、快速

胶体金免疫层析技术操作简单，无需专业的仪器设备、专业的人员，样品也无需处理。一般情况下，5～10min 内直接通过目测得到直观的检测结果[10-12]。

1.2.3 应用范围广

胶体金免疫层析技术可检测的样品多样，如体液、唾液、尿液、全血、血浆、血清等；该技术既可以检测抗体，也可以检测抗原，目前广泛用于生物医药、植物检疫、食品安全检测、农牧业、重金属残留检测、动物疫病诊断、兽药残留检测等领域[3,9]。

1.2.4 灵敏度、特异性高

该技术用高质量的单克隆抗体标记胶体金，诊断下限可达10pg，并且对组织细胞的非特异性吸附作用小，故其灵敏度、特异性高[4,13]。

1.2.5 相对稳定、安全环保

胶体金免疫层析试纸条的保质期一般为12～24个月，通常不需要冷藏。试剂比较稳定，检测结果能长时间保存于室温；无邻苯二胺等有害物质的参与，不会影响操作人员的健康，也不会污染环境[9,14]。

1.2.6 经济实用，便于运输

该试纸条检测时所需的试剂和样本用量少，其中样本用量低至1～2mL。同时该试纸条体积小，方便运输[4,15]。

1.3 胶体金免疫层析技术的分类

胶体金免疫层析技术根据其原理的不同，可分为间接法、夹心法和竞争法。其中，夹心法又分为双抗原夹心法和双抗体夹心法。间接法大多用于检测抗体，常用于病毒或细菌相应血清抗体的检测；竞争法多用于检测仅含有一个免疫结合位点的小分子抗原，例如吗啡；双抗体夹心法多用于检测多表位抗原，常应用于病毒的检测；双抗原夹心法多用于对病原相应抗体的检测[16-18]。

2 在动物疫病诊断中的应用

2.1 在动物病毒性疾病诊断中的应用

目前，根据相关调查和分析发现病毒性疾病是导致畜牧行业动物出现疫情的主要原因[19]。在预防和控制疫情发生方面，准确快速、简便安全的胶体金免疫层析技术显得尤为重要，该技术在动物病毒性疫病诊断中也得到广泛的应用。

丁豪杰等[20]用猪圆环病毒2 型（PCV2)重组衣壳蛋白（dCap)，研制了检测PCV2-dCap 抗体的胶体金免疫层析检测试纸条。结果显示，该方法具有良好的特异性、敏感性以及较好的稳定性和重复性。该检测方法和ELISA 相比较，结果显示阳性符合率为90.5%，阴性符合率为100%，总符合率为91%。Yu[21]等利用鸭坦布苏病毒（DTMUV)的E 蛋白特异性抗体建立了快速检测鸭坦布苏病毒（DTMUV)的胶体金免疫层析试纸条，检测了50 份临床样本，该检测方法与RT-PCR 符合率为93.9%。程婷婷[22]等以OMP31 与BP26 重组蛋白作为检测抗原，建立了一种快速检测布鲁氏菌抗体的胶体金免疫层析试纸条。该试纸条与其他不相关疾病无交叉反应，特异性高。经检测，该试纸条与琥红平板试验方法符合率为92%，说明其具有良好的使用价值，可在基层推广使用。李昕等[23]利用双抗体夹心法建立了检测口蹄疫O、A、Asia1 型病毒胶体金免疫层析定量检测试纸卡，其不仅在O、A、Asia1 血清型口蹄疫病毒间无交叉反应，与其他非口蹄疫病毒也无交叉反应，可应用于快速鉴别口蹄疫病毒抗原、146S 定量检测以及血清分型。

2.2 在动物细菌性疾病诊断中的应用

最近几年，动物细菌性疾病在中国部分地区呈多发状态，在一定程度上严重影响了养殖业的发展。胶体金免疫层析技术在诸如布鲁氏菌病等细菌性疾病的诊、监测和检测断中发挥了极大作用。

许菲菲等[24]基于BP26 蛋白，将BP26 蛋白包被检测线（T)，兔BRU-BP26 抗体包被质控线（C)，研制出了羊布鲁氏菌抗体金标检测试纸条。该方法的特异性和灵敏度分别为94.44%、90.62%，与试管凝集试验总符合率为92.69%。此外，与大肠杆菌O∶157 等6 种细菌均无交叉反应，说明该试纸条是诊断羊布鲁氏病的理想方法。赵越等[25]以重组表位蛋白map0862-2154c 为抗原，建立了牛副结核分枝杆菌抗体胶体检测方法。用该方法在临床样本血清检测结果显示，其敏感性为91.86%，特异性为94.23%，符合率为93.38%，为检测牛副结核病的血清抗体提供了简便、敏感性高、特异性高的检测手段。赵肖等[26]研制了可同时检测Mhp 血清抗体和黏膜抗体的猪肺炎支原体抗体胶体金免疫层析试纸条。该试纸条只需10min 即可得到检测结果，其与商品化的Mhp ELISA 试剂盒的检测符合率为96.1%，对猪肺炎支原体的诊断提供了快速检测技术。

2.3 在寄生虫病诊断中的应用

相比于其他疾病，胶体金免疫层析技术在寄生虫病诊断的应用相对较少，但这方面也有较多的研究成果。

丁豪杰等[27]将胶体金标记VHH-48 和VHH-52抗体蛋白并制备金标垫，再将日本血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA)作为检测线包被物，羊抗鼠IgG 作为质控线包被物，建立了基于抗日本血吸虫虫卵抗原纳米抗体的胶体金试纸条检测方法。结果表明，该方法特异性和敏感性良好。寇金华等[28]利用胶体金标记抗弓形虫表面抗原SAG3 单克隆抗体，制备猪弓形虫血清循环抗原免疫胶体金试纸条。该试纸的灵敏度可达1∶160，在特异性方面，与猪囊虫阳性血清不发生交叉反应。该试纸条在室温条件下，可保存1 个月以上，具有较好的稳定性。杨升等[29]建立了新孢子虫感染牛血清抗体的检测方法。该试纸条以兔抗SPA 包被为质控线，新孢子虫P40 蛋白包被为检测线进行制备。经过测试，该试纸条特异性强、灵敏度高，适用于监测牛新孢子虫的感染。

3 小结

迄今为止，胶体金免疫层析技术因具备多种优点，是目前最成功的商业化POCT 产品之一，也是多个领域研究和应用的热点。因此，该技术一直处于被创新和优化状态。当前，胶体金免疫层析技术已相对成熟，具有广阔的发展前景。但是该技术还有一些不足之处，如质控体系不够严密；相比于其他技术，灵敏度低，易导致假阳性的发生；难以实现定量检测；不能实现抗原抗体的同步检测等。所以，胶体金免疫层析技术应充分利用自身优点的情况下，朝着实现高通量检测、提高灵敏度、实现定量检测以及抗原抗体的同步检测等方面发展，发挥该技术最大的价值，持续为中国养殖业的发展保驾护航[30,31]。