银杏类黄酮代谢研究进展

冯 凯 陈 颖 刘 瑞 马娟娟 赵 斌

（南京林业大学南方现代林业协同创新中心，生物与环境学院，江苏 南京 210037）

银杏（Ginkgo biloba）是最古老的活化石之一，据文献记载，银杏首次出现大约在2.8 亿年前[1]。该树种应用广泛，既是观赏树种又是药材树种，具有较高的生态和经济意义，是原产于我国最重要的经济植物之一，广泛栽培于全球温带和亚热带气候区[2]。银杏叶中富含大量的次生代谢产物，如类黄酮、酚类、萜内酯类、异戊二烯类等，其中最具药用活性的成分是银杏类黄酮与萜内酯[3-4]。21 世纪以来，银杏叶提取物已经成为制药、保健品和化妆品行业最受欢迎的成分之一，银杏叶制剂年销售总额达100 亿美元，已成为全球领先的植物药品种[5-6]。银杏类黄酮物质约有38 种，多以糖苷和甲基化形式存在，有黄酮、二氢黄酮、黄酮醇及其苷类、儿茶素类、双黄酮等[7]。

黄酮类化合物是植物中重要的次生代谢产物，具有增强免疫力、抗癌活性和抗衰老活性等作用[8]，可用于预防和治疗心血管疾病，并且被认为是重要化学防御机制的组成部分，类黄酮的生物合成可以由生物和非生物因素诱导[9]。植物中黄酮类化合物的合成与积累受到多种因素的影响，如光、温度、水、微生物作用以及生长调节剂等[10-11]。银杏类黄酮应用价值很高，并且市场需求日益增加[12]，黄酮类化合物含量的高低取决于银杏苗和细胞培养物的生长发育情况，因此研究银杏黄酮代谢途径，并对银杏苗和细胞培养物进行有效的调控是获得高产黄酮的基础。近年来，国内外学者以环境控制、细胞培养和分子生物学研究等手段对银杏黄酮类化合物代谢机制进行了探索，为实现银杏叶黄酮的规模化生产提供了一定的理论依据和技术支撑。本研究对近年来银杏黄酮的代谢调控研究进行了总结，以期为植物黄酮代谢调控机制地深入探索和银杏叶黄酮产业的发展提供支持。

1 环境因子对黄酮类化合物的代谢调控

1.1 光照对黄酮类化合物合成的调控

光照是植物生长和发育的必要条件之一，不同光照强度，不仅影响植物的初生代谢，还会对植物的次生代谢产生影响[13]。通过对银杏进行不同程度的遮荫处理，可以提高银杏叶类黄酮的含量，遮荫率为30%时效果最佳，银杏叶黄酮含量达到最高[14]。适度遮荫可以保证银杏生长过程中的一些条件处在相对适宜的水平上，又可降低温度，提高糖类的积累，从而促进黄酮类物质合成途径中相关酶的活性。而Xu 等[15]却发现在无遮荫的光照下银杏叶片中黄酮类化合物含量最高，但在遮荫率为76%时，银杏类黄酮的产量达到最高，并且银杏生物量的增加最高，这可能与遮荫下银杏叶生物量增加有关。另外银杏叶类黄酮的积累存在显著光强效应和温度、光强的交互效应，适宜的光照强度（800 μmol/(m2·s)与昼夜平均温度15 ℃/5 ℃）下，银杏单株类黄酮含量显著增加[16]。总的来讲在银杏生长初期适度遮荫有利于叶类黄酮的积累。

1.2 紫外（UV）诱导对黄酮类化合物合成的调控

UV-B 辐射作为植物生长过程中的一种常见胁迫，可以显著促进次生代谢产物的合成[17]，导致植物生长发育、生产能力的改变，而类黄酮是UV-B 的滤除器，吸收UV-B 并清除ROS[18]。有研究发现将采后的银杏叶用UV-B 照射3 h 后银杏叶内的类黄酮含量就显著地增加[19]，但也有学者对银杏苗进行UV-B 处理2 h，发现类黄酮含量先出现下降，之后再进行黑暗处理可以提高类黄酮的含量[20]。在UV-B 的辐射下，银杏叶内类黄酮含量有着明显的提高，其原因可能是UV-B 促进了类黄酮合成途径中的关键酶—PAL（苯丙氨酸解氨酶）活性，加速了L-苯丙氨酸向反式肉桂酸的转化，提供了更多的黄酮化合物前体，提高了类黄酮的含量。另外，不同时期的银杏叶片对UV-B 照射的敏感度不同，老叶对UV-B 辐射的敏感性远低于幼叶，因为幼叶可以迅速建立起抵御有害辐射的保护机制，提高类黄酮的含量[21]。

1.3 温度、水分、盐胁迫及施肥对黄酮类化合物的调控

温度和水分对银杏叶黄酮的影响也很大，当中度干旱时，银杏叶类黄酮含量达到最大值[22]，采用根系分区灌溉的方法也可以显著提高银杏叶中类黄酮的含量[23]。干旱环境胁迫还会影响黄酮化合物的组分，干旱胁迫能增加槲皮素的含量反而抑制芦丁的合成[24]，以上研究说明干旱胁迫有利于叶类黄酮的积累，但是长期的干旱胁迫会抑制PAL 的活性导致类黄酮含量下降[25]，因此在干旱胁迫的程度上要把握得当。多环境交叉调控也能显著提高银杏叶类黄酮的含量，如以不同梯度的水分与温度组合处理银杏幼苗70 d，15 ℃/5 ℃（昼夜）与重度干旱（田间持水量30%～35%）处理条件下，银杏叶中类黄酮含量增加21.8%[26]，而在25 ℃/15 ℃（昼夜变化）和轻度胁迫（田间持水量50%～60%）时槲皮素含量最高[27]。同样，Guo 等[28]研究了不同昼夜温度组合（15 ℃/10 ℃、25 ℃/20 ℃和35 ℃/30 ℃ （昼/夜））对银杏叶片类黄酮积累的影响，15 ℃/10 ℃处理第40 天，总黄酮含量最高。因此，较低的温度 （15 ℃/10 ℃）更有利于类黄酮的积累。另外高温和干旱双重胁迫对银杏叶类黄酮含量的影响更明显，尽管单一胁迫时，干旱胁迫比高温胁迫更能促进类黄酮的合成，但是高温和干旱双重胁迫时可以最大程度地促进银杏叶类黄酮的合成[29]。

多项研究表明盐胁迫也是促进植物体内类黄酮积累的有效方法，植物能够通过调控不同种类的基因和转录组因子，特别是类黄酮的生物合成，提高其对低水平土壤盐度胁迫的耐受能力，以应对环境胁迫[30]。在盐胁迫下，罗布麻中山奈酚与槲皮素含量显著上升[31]，与之相似，盐胁迫同样能够提高银杏叶中类黄酮含量，尤其是槲皮素含量的提升更加显著[32]。

通过施肥的方法也能够改变银杏叶中类黄酮的含量，特别是发酵粪肥与常规施肥相比，在5 个月中类黄酮含量最高提高了28.57%，效果显著[33]。另外，将芽生肥（FBG）和叶生肥（FLG）联合施用，银杏叶类黄酮含量明显提高，说明FBG 与FLG 联合应用是提高银杏叶类黄酮产量的有效途径[34]。

2 细胞培养下黄酮类化合物的代谢调控研究

2.1 诱导子对黄酮类化合物的调控

诱导子的添加成为细胞培养生产次生代谢物的主要调控手段之一。诱导子分为生物诱导子和非生物诱导子。非生物诱导子包括高盐、重金属、生长调节剂、稀土等化学物质和紫外线等物理因子，生物诱导子主要是指真菌孢子、菌丝体等内生菌[35]。

一氧化氮（NO）作为一种生物活性分子，在植物体内具有抗氧化的作用。向银杏悬浮细胞培养液中加入不同浓度的硝普钠（SNP）作为NO的供体可以促进细胞中黄酮类物质的合成，银杏愈伤组织中的总黄酮达到3.37% DW[36]。EL-Beltagi等发现NO 处理银杏悬浮细胞可以增加PAL 的积累，从而增加黄酮类化合物的合成[37]。Hao 等[38]研究表明内生真菌能够促进银杏悬浮细胞中类黄酮的积累，单独用真菌诱导子使银杏悬浮细胞总黄酮含量提高1.8 倍（2% DW），单独用80 μmol/L的脱落酸（ABA）处理可使总黄酮含量提高到2%（DW）。但真菌诱导子与ABA 的共处理效果更明显，类黄酮含量提高到2.5%左右（从图中数据读出）。另外用外源过氧化氢（H2O2）处理银杏细胞，虽然部分抑制悬浮细胞的生长，但能促进总黄酮的合成，最高达18.8 mg/g DW[39]。可见，通过诱导子调控银杏类黄酮的代谢，促进其类黄酮的合成是比较有效的一种策略。

植物生长调节剂是指一些具有天然植物激素活性的人工合成的物质，也是常见的非生物诱导子。如NAA、2,4-D、KT、乙烯利、6-BA 等。其中细胞培养主要使用的是2,4-D、6-BA、NAA以及KT 等。不同配比的NAA 与6-BA 组合对类黄酮生产具有很大影响，Cheng 等对培养基中NAA与6-BA 的配比研究发现MS+2 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA 培养基愈伤组织中黄酮类化合物含量显著高于其他培养基，并在第45 天达到峰值[40]。单一的向培养基中添加2,4-D 时，银杏细胞类黄酮的合成会受到明显的抑制，而将6-BA与2,4-D 组合后会促进愈伤组织类黄酮的合成[41]。对比6-BA与2,4-D 的组合，NAA 与KT 的组合更加适合银杏愈伤组织的生长发育，并且可以提高继代过程中银杏细胞的叶绿素含量[42]。另外，当KT 与不同浓度的2,4-D 组合时，银杏细胞培养物中的黄酮类化合物的含量随2,4-D 浓度的增加而增加[43]。

染料木素（GNT）是大豆中天然存在的异黄酮，近年来的研究表明，GNT 能够促进植物的次生代谢。如外源GNT 可以促进苹果及葡萄花青素的积累[44-45]，说明GNT 能够促进植物类黄酮的积累。而不同浓度的GNT 对银杏类黄酮合成的效果也不同，研究表明50、100 μmol/L 和150 μmol/L的GNT 均能促进银杏类黄酮的合成，类黄酮含量随着GNT 浓度的增加而增加，在150 μmol/L 的GNT 处理下类黄酮含量达到最大值[46]。

5–氨基乙酰丙酸（5-ALA）是植物体内卟啉化合物生物合成的关键前体，能够诱导苯丙烷代谢并促进黄酮类化合物积累。陈磊等[47]研究了ALA 对苹果幼果黄酮类化合物含量的影响，当ALA 浓度低于300 mg/L 时，苹果幼果黄酮类化合物含量随着ALA 浓度的增加而增加，在第9 天含量达到最高，而当ALA 浓度高于400 mg/L 时，苹果幼果黄酮类化合物含量则下降。与其研究结果相似，Xu 等[48]发现采用低浓度的ALA 对银杏叶片进行处理能够有效地提高银杏叶片中黄酮类化合物的含量，是改善银杏叶药理特性的有效手段。总之低浓度的ALA 对植物黄酮类化合物的合成有促进作用。

2.2 微量元素对黄酮类化合物的调控

在银杏的愈伤组织培养中，K+和Mg2+浓度下降都能促进黄酮类化合物的合成，在0.82～1.64 mmol/L K+对黄酮类化合物的促进作用最强；5.2 mmol/L Mg2+时银杏愈伤组织细胞黄酮类化合物的含量达到最大值[49]。矿质元素中的微量元素对银杏悬浮细胞中黄酮类化合物的含量也有重要影响，研究发现在缺少了Mo6+，Cu2+以及Co2+的MS 培养基中黄酮类化合物的含量明显低于未缺少此3 种微量元素的对照样[50]。无机盐和稀土离子也是调控银杏类黄酮合成的较有利的工具。利用不同浓度梯度的NaCl 处理银杏悬浮细胞，低浓度的盐也可促进了黄酮类化合物的合成，但高浓度盐黄酮类化合物的积累量更大[51]。利用50 mmol/L 和150 mmol/L 的NaCl 处理的悬浮细胞类黄酮的产量较高，且分别在第12 天和第8 天收获较好[52]。一定浓度的Ce3+（稀土铈）有利于银杏悬浮细胞生长，促进银杏悬浮细胞的生长，从而有利于银杏细胞类黄酮的积累，提高类黄酮的含量[53]。

2.3 毛状根培养对黄酮类化合物的调控

毛状根培养技术是一项基因工程和细胞工程相结合的技术，其原理是将发根农杆菌中Ri 质粒含有的T-DNA 整合到植物细胞的DNA 上，从而诱导植物细胞产生毛状根。Ri 质粒的转化根可以合成与原植物相同的次生代谢产物，并且拥有一定的遗传稳定性，合成能力较强。通过测定银杏毛状根，可以证明银杏毛状根具有合成黄酮类化合物的能力[54-55]。因此，通过毛状根培养技术建立的悬浮培养体系具有增加黄酮类化合物合成的能力。

2.4 其他途径对黄酮类化合物的调控

前体物是初生代谢产物在代谢过程中的中间体，在细胞培养中加入前体物可以有效提高次生代谢产物的积累。常见的前体物有苯丙氨酸、乙酸钠等。有实验表明，向银杏液体悬浮细胞培养中加入苯丙氨酸对黄酮类化合物的积累有一定的促进作用，但是效果并不是很明显[56]。但是该结果与邵菊芳[57]的研究结果不一致，邵菊芳发现添加苯丙氨酸后，叶细胞黄酮类化合物含量高达23.61 mg/g，说明苯丙氨酸能够有效促进黄酮类化合物积累，是理想的前体添加物。这可能是因为前体物添加的时间、浓度以及对象不同而导致黄酮类化合物的积累有所差异。利用固定化培养技术产生次生代谢产物的研究发展迅速。秦卫东等[58]采用固定化培养技术培养银杏克隆细胞，固定化培养细胞的黄酮类化合物含量比悬浮培养细胞多增长了7 d 且黄酮类化合物生物合成量多出了40%。刘佳佳等[59]采用缺氧胁迫法从愈伤组织中筛选出高产黄酮苷细胞系，其生产黄酮类化合物的能力比原来的愈伤组织明显提高，为银杏细胞大规模生产黄酮类化合物打下了基础。

3 银杏类黄酮代谢调控在分子水平方面的研究

3.1 黄酮类化合物代谢的关键酶调控

苯丙烷代谢途径是黄酮类化合物合成的起始途径，随后经过一系列反应生成黄酮类化合物。与银杏黄酮类化合物代谢相关的途径及关键酶基因见图1。

图1 黄酮类化合物合成途径简图Fig. 1 Synthesis pathway of flavonoids

3.1.1 苯丙氨酸解氨酶（GbPAL）

GbPAL 是银杏苯丙烷代谢途径中的第1 个关键酶和限速酶[60]，能够催化苯丙氨酸生成银杏次生代谢产物的前体物质肉桂酸[61]。GbPAL与大多数植物的PAL不同，GbPAL基因在叶中的表达量最高，而大多数植物的PAL基因在根中的表达量最高，这可能是因为不同物种的PAL基因的表达模式存在一定的差异。在银杏叶的整个发育期中，GbPAL基因的表达量与银杏黄酮类化合物的积累呈正相关[62-63]。另外GbPAL只有在光照下才与黄酮类化合物的合成有关，它的活性受到光的诱导[64-65]。GbPAL在调节植物生长发育和次生代谢产物的合成及抗逆性方面都有重要作用。

3.1.2 肉桂酸-4-羟化酶（GbC4H）

GbC4H 作用于苯丙烷代谢途径中的第2 步，催化反式肉桂酸转化为对香豆酸[66]。通过对银杏肉桂酸-4-羟化酶基因进行克隆发现GbC4H基因在根、茎和叶中的表达水平不同，在根中表达水平最高，并且表达水平受UV-B、ABA、SA、低温和水杨酸的诱导，说明GbC4H与GbPAL一样在植物抗逆性方面具有重要作用[67]。

3.1.3 查尔酮合成酶（GbCHS）

由查尔酮合成酶催化生成的查尔酮能够在后续反应中形成多种黄酮类化合物[68]，CHS的基因表达影响了植物的抗逆性以及生长发育[69]。银杏查尔酮合成酶基因的有关研究表明，查尔酮合成酶基因的转录水平与遗传、激素、光照等条件有关，查尔酮合成酶与银杏叶的类黄酮含量呈正相关[70]。

3.1.4 黄烷酮-3-羟化酶（GbF3H）

黄烷酮-3-羟化酶是黄烷酮分支点的一个核心酶，其活性对于黄酮类化合物的生物合成是必需的[71]。通过GbF3H基因的表达分析显示该基因在叶中的表达含量最高，而在根中没有表达，这可能是因为叶片是积累黄酮类化合物合成的主要器官。另外通过GbF3H基因的系统发生树分析显示GbF3H与拟南芥等植物的F3H来源于共同的祖先[72]，因此可以通过研究其他植物的F3H基因调控黄酮类化合物合成的机理来探索出GbF3H对于银杏黄酮类化合物合成的调控机制。

3.1.5 类黄酮3'羟化酶（GbF3'H）

类黄酮3'羟化酶是黄酮代谢途径中的关键酶，与黄酮醇合酶、黄烷酮醇4–还原酶共同竞争底物，控制黄酮类物质的合成流向。组织表达分析表明，类黄酮3'羟化酶在银杏雄蕊中表达最高，成熟叶次之。并且类黄酮3'羟化酶基因的转录水平变化与花青苷相关，影响不同组织中黄酮类化合物的含量[73]。

3.1.6 4-香豆酸辅酶A 连接酶（Gb4CL）

4-香豆酸辅酶A 连接酶是苯丙氨酸途径中的关键性限速酶，催化肉桂酸产生硫酯并使得硫酯位于苯丙烷代谢途径的分支处。雷静等[74]从银杏中克隆到了4CL的cDNA 片段，命名为Gb4CL。Gb4CL编码的蛋白质与日本柳杉（Cryptomeria japonica）、白豆杉（Pseudotaxus chienii）、北美云杉（Picea sitchensis）的4CL氨基酸同源性分别为82%、83%、80%。4CL系统进化树显示，Gb4CL与裸子植物亲缘关系最近。这表明4CL基因与植物的进化过程有一定的关系。通过研究与银杏亲缘关系相近的树种的4CL基因，可为掌握银杏黄酮类化合物合成中关键基因的调控机理提供参考。

3.1.7 黄酮醇合酶（GbFLS）

FLS 能够让黄酮结构中的C-3 位羟基化，形成黄酮醇[75]。通过对FLS基因的启动子结构研究[76]，发现银杏FLS基因启动子区中GC 含量较低，AT 含量较高，这说明了银杏FLS基因启动子区的双链链接松散，方便转录因子的结合。因此，可以通过这一特点来研究银杏FLS基因在黄酮类化合物积累上的调控机理。Xu 等[77]使用高效液相色谱法体外酶活性测定结果表明，重组GbFLS 蛋白可以催化二氢山奈酚形成山奈酚并将山奈酚从柚皮苷转化为山奈酚，说明GbFLS 是黄酮醇生物合成途径中的双功能酶。

3.2 黄酮类化合物代谢的转录因子调控

MYB 家族在植物的代谢生长中发挥着重要作用[78]，与黄酮代谢相关基因的表达受到MYB 转录因子的调控[79-80]。GbMYBR1被发现在多种情况下起抑制作用，如在拟南芥中过表达GbMYBR1导致叶片花青素和黄酮醇含量下降[81]。Xu 等[82]通过序列分析鉴定出少数R2R3 型MYB 基因，其中2 个基因与类黄酮调控相关。MYB 的结合位点存在于GbCHI、GbANS启动子区域[83]，说明银杏黄酮类化合物代谢有关基因的表达与MYB 转录因子有关。另外同一种MYB 转录因子可以响应多种胁迫[84]。

bHLH 转录因子是一种普遍存在于动植物中的转录因子家族，目前植物基因组中的bHLH 数量已经远远超过了动物中的数量[85]。GbbHLH91是从银杏叶中分离得到的1 个bHLH基因的cDNA序列。GbbHLH91基因在雄花中的表达量最低但是在叶中表达量却很高，与之较为巧合的是相较于其他组织来说，黄酮类化合物在银杏叶中的含量最高[86]，因此可以推测GbbHLH91基因可能与黄酮代谢有关。 bHLH 本身并不能激活黄酮合成途径的酶基因的启动子，但是与MYB 转录因子共同作用时可以明显激活这些酶基因[87]。此外，人们通过基因表达与类黄酮含量的相关性分析，筛选出7 个与类黄酮生物合成相关的GbbHLH候选基因，为通过基因工程提高银杏类黄酮产量提供参考[88]。

WD40 转录因子又称WDR 蛋白，是一种高度丰富的蛋白，参与一系列广泛的细胞功能，起到支架分子的作用，因此结构稳定。WD40 转录因子在植物生长发育以及响应外界胁迫方面十分关键，并且在黄酮类化合物的代谢调控中发挥着重要作用[89]。目前人们已经从银杏叶片中分离出了GbWD401及GbWD402[90]，为WDR 蛋白的深入研究提供参考。

经过深入研究，人们发现多个转录因子能够共同调控黄酮类化合物的代谢。如白杨中PalbHLH1和PalMYB90共同表达不仅促进了花青素等次生代谢物的积累，而且提高了中间产物槲皮素和山奈酚的含量[91]。并且很多研究表明，由3 种调控蛋白（MYB、bHLH、WD40）组成的MBW 复合物能够促进植物类黄酮的积累，如拟南芥通过形成MBW 复合物参与花青素的合成，以响应某些营养条件和环境条件[92]。不仅如此，研究者发现拟南芥中整个苯丙烷代谢途径中的基因基本都由MBW 调控[93]。而银杏关于多种转录因子共同调控类黄酮合成的报道较少，这将是人们日后研究银杏类黄酮代谢的新方向。

3.3 黄酮类化合物代谢的转录组和miRNA、lncRNA的调控

2016 年银杏全基因组测序完成[94]，银杏基因组数据的公布促进了银杏的系统研究。有研究通过RNA-Seq 对银杏转录组的分析，获得了70 752个转录本和49 396 个特异转录本，其中约60%的转录本为201～1 000 bp，可为今后基因克隆等分子工程的研究提供更好的生物信息学资源[95]。 Guo等[96]通过RNA-Seq 对银杏转录组进行分析，鉴定了23 个bHLH 和9 个MYB 转录因子基因，并发现与MYB 相关的5 个基因表达上调，该基因可能在黄酮类化合物的生物合成中发挥关键作用。Wu 等[97]对不同黄酮类化合物含量的银杏进行了转录组测序，发现了14 个类黄酮转运富集基因，1 个二氢类黄酮醇还原酶（DFR）基因参与类黄酮转运途径，结果提供了关于银杏转录组的全面的基因表达信息，可以帮助了解银杏类黄酮的分子机制。研究者采用高通量测序技术对银杏胚珠及叶片进行了数字基因表达谱分析[98]，发现胚珠中一些黄酮类化合物合成相关酶的表达水平也很高，根据该结果推测银杏胚珠也有提取黄酮类化合物的价值。

miRNA 是控制植物基因表达的重要调控因子，通过调控此类代谢物合成的关键酶及转录因子来调节黄酮类化合物，在植物发育、细胞增殖和代谢等一系列生物学过程中发挥重要作用[99]。如拟南芥中miR156 靶向SPL9 转录因子，该转录因子与黄酮类化合物合成相关基因表达有关，上调miR156 可使花色素苷积累，下调miR156 可使黄酮类化合物含量提高[100]。研究者通过测序技术来识别和定量分析银杏叶片中的miRNA，研究发现miRNA 高表达的靶基因主要参与植物与病原菌的相互作用、植物激素信号转导和黄酮类化合物的合成。其中gbl-miR102，gbl-miR174，miR 1108 和miR1854 参与了类黄酮生物合成的调控[101]。通过金叶银杏与绿叶银杏经转录组分析和注释表明miRNA 在银杏叶片中的潜在作用包括苯丙氨酸代谢，通过qRT-PCR 进一步验证miRNA 及其靶点发现金叶银杏中miR159a 和miR159c 参与了银杏叶绿体发育及激素代谢，可能也与类黄酮代谢有关[102]。大量已知的和一些新的miRNA 及其靶基因参与了植物叶发育得调控，因此可以利用miRNA 对次生代谢进行调控，如直接对miRNA的靶基因相关的生物合成酶基因或转录因子进行控制，来调控次生代谢物的合成；也可以通过miRNA 抑制编码某种次生代谢物合成的负调控因子来促进次生代谢物的合成。

长度超过200 个核苷酸的非编码RNA 称为长链非编码RNA（lncRNA）[103]。许多lncRNA 参与了类黄酮、类胡萝卜素、生物碱等次生代谢产物的合成，在植物的胁迫反应中起到重要作用[104]。有研究者预测了14 个lncRNA 靶向16 个涉及次生代谢通路的基因，如Gb10032和Gb25343参与了类黄酮的合成[105]。有研究鉴定了lncRNA 靶向的4 个与类黄酮生物合成相关的基因，这些基因在银杏类黄酮合成中具有重要作用，该发现有助于鉴定植物中调控lncRNA 的基因[106]。但是lncRNA 具体如何调控银杏类黄酮的研究较少，从lncRNA 入手研究银杏类黄酮合成将是一个新的方向。

4 研究展望

人们目前对银杏类黄酮的代谢调控机制有了一定的了解，包括从逆境胁迫条件如光照、温度、水分来调控银杏类黄酮的积累，再到细胞培养研究以及基因克隆、高通量测序等技术，发现了大量与银杏类黄酮积累有关的转录因子和功能基因。但是由于类黄酮代谢通路的复杂性使目前这些研究大部分还停留在表面基础研究，关于MYB 等转录因子在代谢途径中的具体作用目前并没有详细的结果，各基因之间的联系以及调控机制还较为模糊，基因成簇性表达，使得仅仅对单个功能基因与转录因子进行研究不足以完全阐明银杏类黄酮的代谢机制，并且多个转录因子共同调控银杏类黄酮合成的研究较少。因此发现更多的转录因子和转录因子间的相互作用以及克隆更多的关键酶基因将有利于构建出完整的银杏类黄酮代谢调控网络。lncRNA 也是参与植物次生代谢产物积累的重要组成部分，而银杏类黄酮关于这部分的研究结果较少，探究lncRNA 影响银杏类黄酮合成的具体机制也不清晰。另外，目前研究者大多仅关注与类黄酮代谢途径相关酶的调控，对其上游的碳流代谢及能量分配、下游物质流向的综合研究涉及较少。伴随着银杏全基因组测序的完成，遗传图谱构建、SLAF 标记、甲基化测序等技术能够帮助人们更加深入、有效地研究银杏基因调控网络，通过基因编辑技术敲除限制黄酮合成的一些相关基因，建立高产黄酮株系，实现黄酮的大量合成，成为基因工程的一个新亮点。目前合成生物学已成为生物工程的一个新的研究领域，因此借助于成熟的银杏细胞培养系统，从DNA 分子、基因片段、基因调控网络与信号传导路径到工程细胞对其进行人工设计与合成，通过遗传工程与细胞工程结合将细胞变成生产类黄酮的微型工厂，将是未来发展的方向。