长链非编码RNA lnc02126在尤文氏肉瘤中的表达及与预后的关系△

连笑宇，王彦飚，王家林，王宏博，刘斌峰，刘震东，高延征

（郑州大学人民医院，河南省人民医院脊柱脊髓外科，河南郑州 450003）

尤文氏肉瘤（Ewing's sarcoma）是一种侵袭性的恶性骨和软组织肿瘤，起源于间充质干细胞，是儿童和青少年中仅次于骨肉瘤的第二大常见的原发性骨恶性肿瘤，尤其在 10～20 岁发病率最高[1，2]。尽管经过手术切除及放化疗等综合治疗后，尤文氏肉瘤患者的总体生存预后会得到一定改善，但尤文氏肉瘤具有易转移至肺及其他组织的生物学特性，致使肿瘤转移后患者的死亡率仍高居不下[3，4]。导致这种不利局面的主要原因是对于尤文氏肉瘤的病理发病机制尚未能全面理解，并且缺乏有高特异性和敏感性的生物标记物作为实现个体化诊治方案的靶点。因此，找到高特异性的新型治疗策略迫在眉睫。长链非编解码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的ncRNA的亚类，没有开放阅读框，不具备编码蛋白的能力[5]。近年来已有研究表明，lncRNA具有强大的基因调控功能，其中包括：表观遗传调控、控制转录、调节mRNA的稳定性、翻译和翻译后的修饰等，与神经系统疾病、内分泌失调和多种癌症有着千丝万缕的关系[6-9]。本研究基于ICGC数据库的筛选，首次发现lnc02126可能是一个新的致癌候选基因。鉴于此，本研究进一步分析lnc02126在尤文氏肉瘤中的表达水平、临床意义以及潜在的发生发展机制，以期为尤文氏肉瘤的诊断和治疗确立一个新颖的生物靶点。

1 材料与方法

1.1 数据收集

国际癌症基因组联合体（International Cancer Genome Consortium,ICGC，https://daco.icgc.org/） 收集了50种不同癌症类型（或亚型）的肿瘤相关数据，旨在揭示造成全人类疾病负担的多种癌症的基因组变化[10]。在排除临床信息不完整的数据后，从ICGC数据库中获得了56例尤文氏肉瘤患者的基因表达数据及相关临床信息用于进一步分析。

1.2 细胞培养及实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（RT-qPCR）

人尤文肉瘤细胞株RD-ES和相应的正常细胞株（人骨髓间充质干细胞，HBMSC）均购买自上海舜冉HAKATA细胞库（http://www.xrshbio.com/），使用含有 10%胎牛血清（FBS，Gibco）的DMEM培养基（HyClone），并在37℃和5% CO2的孵箱环境中对上述细胞进行培养。使用Total RNA Kit I（Omega Biotek）试剂盒提取细胞中的总RNA。随后，使用超微量分光光度计（NanoDrop One spectrophotometer,Thermo Fisher Scientific）测定RNA溶度并进行反转录得到cDNA（NovoScript Plus All-in-one 1stStrand cDNA Synthesis SuperMix,Novoprotein）。最后，使用NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus （Novoprotein）试剂盒进行RT-qPCR测定lnc02126的表达水平。管家基因GAPDH及lnc02126的引物序列如下：（GAPDH-上游：5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3',GAPDH-下游：5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3',lnc02126-上游：5'-CCCTGTTCACATGGGTTCTCA-3',lnc02126-下游：5'-AAGCCGGACTTCCAGATTCA-3')。

1.3 功能富集分析

基因本体（gene ontology,GO）包含了基因参与的生物过程（biological process,BP），细胞组分（cellular component,CC），发挥的分子功能（molecular function,MF）三方面功能信息[11]。KEGG数据库（https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）是由日本京都大学生物信息学中心建立的基因组信息数据库。KEGG数据库系统地分析基因产物在细胞中的代谢途径以及这些基因产物功能，并整合了基因组、化学分子和生化系统等方面的数据，包括代谢通路、药物、疾病、基因序列及基因组等[12]。根据数据集将尤文氏肉瘤患者分为高表达和低表达两组。筛选出两组间差异表达基因。以logFC≥1且P＜0.05的基因项为差异具有统计学意义。本研究利用clusterProfiler R语言包对lnc02126的进行了GO和KEGG注释分析。

1.3 CMap分析

CMap数据库（Connectivity Map,https://portals.broadinstitute.org/cmap），是由哈佛大学建立的药物研发系统，是发现药物潜在治疗作用的常用工具之一[13]。因此基于CMap分析的原理，该研究将与lnc02126具有差异性关系的基因分为上调和下调基因加载到CMap数据库中。随后根据剪切标准（P＜0.005和富集指数＜-0.7）去获取对尤文氏肉瘤具有治疗作用的候选药物。最后在PubChem查找这些药物的化学结构式和二维结构、三维结构。

1.4 统计学方法

本研究中所有的统计数据均通过R语言软件（v.4.0.3）进行分析。首先将ICGC数据库中获得的基因表达数据根据lnc02126表达水平分为高表达组和低表达组，然后利用Kaplan-Meier方法和Cox回归模型对与尤文氏肉瘤患者生存相关的临床病理特征和预后进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lnc02126对尤文氏肉瘤患者的生存结果影响及诊断价值

Kaplan-Meier生存分析显示，lnc02126高表达组的预后明显低于lnc02126低表达组，这表明lnc02126异常高表达与尤文氏肉瘤的预后密切相关（图1）。与此同时，为了判断lnc02126作为尤文氏肉瘤预后指标的可靠性，绘制了受试者工作特征曲线（ROC），3年曲线下面积（AUC）值为0.664，5年AUC为0.717（图2），这意味着lnc02126对尤文氏肉瘤预后具有一定的诊断价值。

图1 Kaplan-Meier方法分析显示lnc02126的高表达导致尤文氏肉瘤预后不良

图2 lnc02126在尤文氏肉瘤患者中的预后诊断价值

2.2 lnc02126的异常高表达是尤文氏肉瘤患者的独立危险因素

单因素分析表明，lnc02126的高表达（图3a）导致尤文氏肉瘤患者的预后较差（P=0.001，HR=4.006，95%CI1.717～9.343），复发病例 （P＜0.001，HR=2.348，95%CI1.637～3.367）。随后，多因素分析（图3b）将用于使用Cox回归模型进行进一步分析。与导致尤文氏肉瘤发生相关的lnc02126表达（P=0.035，HR=2.638，95%CI1.071～6.459），复发病例（P＜0.001，HR=2.342，95%CI1.572～3.490）。

图3 影响尤文氏肉瘤预后的单因素和多因素分析3a:单因素分析 3b:多因素分析

2.3 lnc02126在尤文肉瘤细胞中异常高表达

为了验证上述分析结果，该研究进一步用RT-qPCR检测了尤文氏肉瘤细胞株（RD-ES）和正常细胞株（HBMSC）中lnc02126的表达水平。结果表明，与HBMSC相比，lnc02126在尤文氏肉瘤细胞株中异常高表达。

图4 尤文氏肉瘤细胞及相应正常对照细胞中lnc02126的表达水平，**P＜0.005

2.4 lnc02126的GO分析及KEGG分析

通过GO分析和KEGG分析进一步了解lnc02126的生物过程（biological process,BP）、细胞定位（cellular component,CC）、分子功能（molecular function,MF）及相关信号通路。图5a提示其可能参与了细胞外的结构组织构建（如细胞外基质）、细胞黏附等生物学过程，并可能在其中发挥了重要的作用，参与了癌症的发生和发展。KEGG分析结果表明lnc02126可能参与了多种与肿瘤密切相关的信号通路，如细胞外基质组织的构建、血管生成和发育的调节以及白细胞的迁移和活化等（图5b）。

图5 lnc02126的GO分析及KEGG分析 5a:尤文氏肉瘤中lnc02126相关的GO生物学信号途径 5b:尤文氏肉瘤中lnc02126相关的KEGG生物学信号途径

2.5 药物分析

该研究以lnc02126为治疗靶点预测了3种可能对尤文氏肉瘤有潜在治疗作用的药物：伊洛前列素、石蒜碱、毒胡萝卜素（表1）。这些小分子药物的二维和三维结构可从PubChem获得，如图6所示。

表1 对尤文氏肉瘤具有潜在治疗作用的三种药物

图6 对尤文氏肉瘤具有潜在治疗作用的药物（药物名称、化学结构、二维结构、三维结构）

3 讨 论

越来越多的文献证明了lncRNA在一系列人类疾病中起着重要的作用，如神经系统疾病、内分泌失调和多种癌症[9，14]。尤文氏肉瘤是儿童及青少年常见的恶性肿瘤之一。已有文献报道多种lncRNA与尤文氏肉瘤的发生发展密切相关。例如，lncRNA-DLX6-AS1可以通过调节miR-124-3p/CDK4并构建级联调节来促进尤文氏肉瘤的发生[15]。Ma等[16]研究发现lncRNA SOX2OT的表达水平升高与尤文氏肉瘤的恶性生物学行为密切相关。然而，到目前为止尚未有关于lnc02126与尤文氏肉瘤的文献报道。

本研究致力于探讨lnc02126对尤文氏肉瘤患者预后的影响及其可能的机制，这将有助于在现有治疗方法的基础上建立新的治疗靶点。首先，Kaplan-Meier生存分析方法发现尤文氏肉瘤患者中lnc02126高表达者生存预后较差。随后单因素和多因素分析表明：lnc02126异常高表达可作为尤文氏肉瘤患者预后的独立风险因素。除此之外，采用ROC曲线分析lnc02126对尤文氏肉瘤的预测价值，结果显示5年AUC值为0.717，说明lnc02126评估尤文氏肉瘤的预后具有一定的价值。最后，本研究通过RT-qPCR进一步验证了lnc02126在尤文氏肉瘤细胞中表达变化，结果显示lnc02126在尤文氏肉瘤中显著高表达。

为进一步揭示lnc02126在尤文氏肉瘤发生发展中可能的分子机制，本研究对公共数据库中获得的数据进行了GO和KEGG注释分析，并鉴定其重要的信号通路。图5中GO和KEGG分析提示其可能参与了细胞外的结构组织构建（如细胞外基质）、细胞黏附、血管生成和发育的调节以及白细胞的迁移和活化等生物学过程。众所周知，肿瘤是由多种细胞、因子共同作用产生的，它存在于一个动态且复杂的细胞生态系统。有研究表明：癌症的发展过程是恶性细胞嵌入由不同的非转化细胞类型和细胞外基质组成的复杂微环境中的过程。除此之外，癌细胞激活的正常成纤维细胞有助于细胞外基质组织构建，有利于增加癌细胞迁移能力[17，18]。肿瘤血管生成是在内皮细胞对局部刺激产生反应并向生长的肿瘤转移时开始的，其结果是形成由血管周围支持细胞包围的管状结构，将血液输送到肿瘤内部。反过来，新血管系统支持肿瘤的发展和最终的转移[19]。因此，lnc02126可能通过这些信号通路促进尤文氏肉瘤的发生、增殖、迁移和复发。

本研究通过CMap分析筛选出3种可能抑制尤文氏肉瘤发生发展的小分子药物：石蒜碱、伊洛前列素、毒胡萝卜素。这些小分子药物对肿瘤的潜在治疗作用已经在先前的研究中被证实。例如，石蒜碱通过靶向信号转导和转录激活因子3（STAT3）信号通路能够显著抑制乳腺癌细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡[20]。与此同时，伊洛前列素和毒胡萝卜素的抗癌作用也逐渐被揭示[21-23]。这些小分子药物对人类多种肿瘤恶性生长具有抑制作用。

综上所述，本研究表明lnc02126在尤文氏肉瘤中的异常高表达导致尤文氏肉瘤患者的总生存率下降，并可以作为一个独立的预后因素。此外，研究发现lnc02126可能通过细胞外的结构组织构建、细胞黏附、血管生成和发育的调节等信号途径参与尤文氏肉瘤的病理过程。而三种小分子药物——石蒜碱、伊洛前列素、毒胡萝卜素在尤文氏肉瘤的临床治疗中具有重要的潜在价值。相信本研究可以进一步提高对尤文氏肉瘤发病机制的认识，并为尤文氏肉瘤患者的诊断和预后提供了一个新颖的、有效的生物标志物。