西瓜种子EMS诱变技术

申赛亚，曾红霞，任 俭，柴姗姗，孙玉宏，张 娜

（1.武汉市农业科学院作物研究所，武汉 430345；2.华中农业大学园艺林学学院，武汉 430070；3.山东农业大学园艺科学与工程学院，山东 泰安 271018）

西瓜（CitrulluslanatusL.）作为世界性的园艺作物，营养价值十分丰富，受到人们广泛喜爱。但其自身抵抗生物胁迫和非生物胁迫能力脆弱，很大程度上制约了品质和产量的提高［1］。且育种学家长期带有偏好性的选育造成一些性状丢失使得西瓜多样化育种进展缓慢，难以实现育种效率的突破，而借助诱变技术创建饱满突变体库可为西瓜育种提供崭新的种质资源，推动种质创新，有效打破当前西瓜育种工作所面临的现状［1，2］。

诱变技术包括物理诱变［3］、化学诱变［4-6］、生物诱变和空间诱变［5］等。其中，化学诱变技术具有操作简便、价格低廉、诱变剂量容易控制且对基因组损伤小、突变频率高、突变范围广、时间周期短的特点，在多种作物中均有应用［7-15］，已成为近年来运用最为广泛的诱变技术，产生了较大的经济效益和社会效益［16-18］。甲基磺酸乙酯（EMS）是应用最多、效果最为明显的化学诱变剂［2，15，19-22］，具有高效稳定、易点突变、染色体畸变频率低、诱变效果好及可针对性改良某种特殊性状等优势，在多种作物中均有应用，如水稻［23-25］、玉米［26］、白菜［27］、茄子［28］、甜瓜［29］、番茄［30，31］等。经过EMS诱导后的突变体库对于功能基因研究具有重要意义［7，32，33］。种子作为最常见的诱变材料具有操作简便、对操作环境要求不高、无需无菌操作、工作量小并在诱变后变异性状经几代积累后可长期稳定遗传的优点，便于大批量诱变研究［15，21，34］。相比于其他作物，西瓜利用EMS构建突变体库起步较晚，2015年朱娜娜［1］研究发现1.0%浓度下诱导9 h为西瓜W1-17种子的最佳诱变条件，之后通过观察M1代、M2代的农艺性状，构建出具有48种变异类型的突变体库。明确EMS最佳处理条件是进行诱变育种研究的关键，公认的最佳诱变剂量是经诱变处理后植株存活50%的半致死剂量，可在保证产生较大变异的基础上不过大损伤诱变材料从而达到良好的诱变效果［35］，并且研究表明诱变浓度、诱变时间及诱变材料等因素对诱变效率均会产生不同程度的影响［12，35-38］。

本研究以武汉市农业科学院西甜瓜研究室供给的高代自交西瓜‘97103’为研究对象，利用EMS对其种子进行诱变处理，分析其西瓜发芽率、成苗率，进而获得西瓜种子诱变的适宜处理组合，为西瓜种质资源的创新提供种质基础和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为高代自交的西瓜‘97103’种子，由武汉市农业科学院西甜瓜研究室供给。该西瓜品种特点有花皮、中果、果肉红、肉质酥脆，适应性强。

EMS试剂购自Sigma公司，为无色溶液，微溶于水。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 用KH2PO4和K2HPO4·3H2O配制成pH为7.0的0.1 mol/L磷酸缓冲溶液后，将EMS诱变剂稀释成不同浓度，Na2S2O3为诱变终止剂和解毒剂。

1.2.2 EMS诱变处理 试验共设置18个诱变处理组合，每处理50粒种子，3次重复。在通风橱中使用25 mL EMS试剂浸种，共设置6个EMS浓度梯度（0%、1.5%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%），以磷酸缓冲液浸泡种子作为对照，标记为0，将各组种子分别置于28℃、90 r/min摇床上避光振荡诱导4、8、12 h。诱变完成后倒掉诱变剂，用Na2S2O3溶液进行解毒处理：加入配制好的25 mL 1 mol/L Na2S2O3溶液，混匀后弃去；然后加入25 mL 100 mmol/L的Na2S2O3溶液，混匀5 min后弃去溶液，再用100 mmol/L Na2S2O3溶液冲洗种子3遍；注入25 mL去离子水混匀5 min后，弃去溶液，去离子水反复冲洗种子3次；最后用流水冲洗种子2 h后进行发芽培养。

结合发芽、成苗的半致死率来确定最佳诱变组合。

1.2.3 催芽方法和发芽率测定 采用培养皿滤纸法进行发芽试验，将诱导后的种子置于有吸水纸的培养皿中，微微润湿，种子上附一层遮光纸，28℃的恒温箱催芽，观察记录发芽情况。当种子露白2 mm时记作发芽，共计催芽7 d（当天发芽的种子需当天播种），每天统计各处理发芽数，计算发芽率。

发芽率=（种子总发芽数量/供试种子数量）×100% （1）

1.2.4 出苗率和成苗率的测定 播种于70孔的育苗穴盘中，每天早上观察记录种子出苗情况。子叶露出土层1.5 cm记作萌发，两叶一心作为成苗依据，于30 d时统计各处理成苗数，计算成苗率。

成苗率=（成活苗总数/供试种子数）×100%（2）

本试验将经过最佳诱变处理后的种子长至两叶一心时进行定植，观察记录西瓜植株的全生育期性状，2021年5月进行自花授粉，6月单瓜收种。

1.3 数据处理

采用SPSS软件进行统计分析。采用Excel、Origin 2019 b软件进行数据处理及绘图。

2 结果与分析

2.1 不同EMS诱变处理对西瓜种子发芽率的影响

由图1、表1可知，1.5%和2.0%浓度处理下的发芽率变动幅度较小，而当EMS诱导浓度超过3.0%时，发芽率下降趋势增强。5.0%浓度处理4 h的发芽率为90%，相较于0浓度处理下的4 h发芽率降低了10.00个百分点；而相同5.0%浓度处理12 h的发芽率仅51.33%，相较于4 h的5.0%浓度降低了38.67个百分点，相较于0浓度下处理4 h的发芽率降低了48.67个百分点。说明诱变时间越长发芽抑制效果越明显。

图1 EMS不同浓度对西瓜‘97103’种子发芽率的影响

由图2和表1可知，在一定范围内，随着处理浓度的增大，西瓜种子发芽率下降趋势明显。其中，不同诱变浓度诱导4 h，整体发芽率下降幅度较小，5.0%浓度处理下的发芽率较0浓度处理降低了10.00个百分点；而当诱导时间超过8 h时，不同诱导浓度处理下发芽率下降较快，其中，1.5%浓度处理8 h时发芽率为99.33%，而5.0%浓度处理8 h发芽率下降至60.67%，较处理4 h降低了29.33个百分点，相较于0浓度处理8 h降低了38.66个百分点。表明在一定范围内，随着EMS处理浓度的增大，西瓜种子发芽所受的制约作用增强。

表1 不同EMS处理对西瓜种子‘97103’发芽率的影响（单位：%）

图2 不同EMS诱变时间对西瓜‘97103’种子发芽率的影响

综上可知，随着EMS诱变处理时间的延长，诱变浓度的增大，西瓜种子发芽率下降趋势明显。诱变浓度愈大及诱变时间愈长，对西瓜种子发芽抑制作用越强。

2.2 不同EMS诱变处理对西瓜种子成苗率的影响

由表2可知，当诱变时间为12 h时，诱变浓度5.0%的成苗率相较于1.5%浓度显著降低49.33个百分点。随着诱变时间的延长，EMS诱变对西瓜种子成苗的抑制效果更加明显。在5.0%诱变浓度下，随着诱导时间从4 h增至12 h，西瓜种子成苗率降低了45.33个百分点。

由图3和表2可知，1.5%和2.0%浓度处理下的成苗率变动幅度较小，而当EMS诱变浓度达到或超过3.0%时，成苗率下降趋势明显。5.0%浓度处理8 h成苗率为53.33%，接近半致死数，而当相同处理浓度下处理12 h成苗率跌至40.67%，远超出半致死数。说明在一定浓度范围内，随着处理时间的延长，EMS诱变对西瓜种子成苗的抑制作用增强。

图3 不同EMS诱变时间对西瓜‘97103’种子成苗率的影响

由图4和表2可知，不同诱变浓度诱变4 h，整体成苗率下降较缓，5.0%浓度处理下的成苗率较对照仅降低了13.33个百分点。而当诱变时间超过8 h时，不同诱导浓度下成苗率下降较快，其中，2.0%浓度下处理12 h成苗率为88.00%，而5.0%浓度处理下成苗率下降至40.67%，降低了47.33个百分点。可见，在一定范围内，随着处理浓度的增大，EMS诱变对西瓜种子成苗的抑制作用增强。

图4 不同EMS诱变浓度对西瓜‘97103’种子成苗率的影响

表2 不同EMS处理对西瓜种子‘97103’成苗率的影响（单位：%）

综上所述，随着EMS诱变浓度的增大，处理时间的延长，西瓜种子成苗率呈下降趋势。EMS诱变浓度愈大及诱变时间愈长，对西瓜种子成苗的抑制作用越强。

3 小结

EMS作为主流的化学诱变剂，具有诱变频率高、诱变效率好、诱变范围广、易产生点突变、染色体畸变少等特点，较常见的诱变材料有种子［32］、花粉［26，39］、叶片［40，41］、茎段［16，42］、愈伤组织［20］、丛生芽［43］等。种子具有其他材料不可比拟的优势：第一，其操作简便、无需大型仪器［21］；第二，相对于运用组织培养的方式而言，诱变叶片、茎段、愈伤、丛生芽对操作环境要求低，无需无菌操作；第三，经诱变后变异性状经几代积累后能长期稳定遗传，可进行大批量诱变研究。故本研究以‘97103’种子为研究材料进行EMS诱变处理。

EMS诱变育种的目的是获得变异材料进行种质创新，因此确定最佳的诱变条件至关重要。这就需要尽可能在保证产生较大变异的基础上又不过大损伤诱变材料从而保证产生足够的诱变率和成活率，现广为认可的最佳诱变条件是经诱变处理后存活50%的半致死剂量。关于存活的定义出现多种理解，其中，宋燕妮［37］、程蛟文等［36］、尚娜［44］采用发芽率作为分析指标，但这不能保证一定的存活株数，无法产生足够大的突变群体。王春霞等［45］、王学征等［2］、薛红霞等［46］以成苗率作为半致死剂量指标构建了突变群体。考虑到以上因素本研究在关注发芽率的同时也关注成苗率，并以两叶一心作为成苗标准，以此确定最佳诱变条件，进而保证一定的诱变率和成活率。

本试验通过设置18个诱变组合（3个时间，6个浓度梯度）处理西瓜‘97103’种子，统计分析不同处理条件下西瓜种子的发芽率及成苗率，发现5.0%的EMS处理8 h的发芽率、成苗率接近半致死剂量，从而明确了西瓜‘97103’种子诱变的理想条件是5.0%的EMS处理8 h。而现有的构建西瓜突变体库的研究中，EMS最佳诱变剂量均小于2.5%。除受种子开壳与否、浸种时间的因素影响外，也可能与西瓜‘97103’种子本身具有较强的EMS耐受性有关。前人研究认为EMS浓度和诱变时间皆会对发芽率、成苗率产生影响，浓度越高、处理时间越长下降愈显著［45］，本研究得出相同结论。将诱变后的植株进行全生育期的观察，可以看到皱缩叶、叶缘变圆、缩小叶、叶色变蓝、叶变狭长、畸形叶、嵌合体、节间缩短等多种类型突变体。随着测序技术的迅猛发展，西瓜全基因组学研究已进入后基因组学时代。通过西瓜突变体库的构建与测序技术的结合可明确突变基因及功能，有助于西瓜分子育种及进行相关农艺性状基因分子机制的研究。本研究结果为构建西瓜突变体库及西瓜相关功能基因组学研究提供了材料基础。