碱性蛋白酶提取辣木籽多肽的工艺研究

郑韵英,梁敏丽,莫柳艳,劳燕芹,胡汉娇

(北部湾大学石油与化工学院,广西 钦州 535011)

辣木籽为辣木的种子,呈球状,直径大概8 mm,其种子壳为褐色,有三棱,在种子的基部有膜质的翅[1]。辣木籽营养丰富,大量研究表明,辣木含有多种营养化学物质及人体所需的生命元素,如P、K、Mg、Na、Ca、Fe、Cu、Zn、Se 等元素[2]。辣木籽还有净化水源[3]、抗菌[4]、抗癌[5]、抗病毒、抗氧化、护肝[6]、降三高[7-8]等功效。辣木籽中的各成分具有一定的生理和药理作用,其中多肽具有抗氧化性、降血压等功能和易吸收、无毒副作用等优点,广泛应用于医药、化妆品、食品等行业[9]。

目前国内外对于生物多肽的提取方法主要有:酶解法[10]、碱溶酸沉法[11]、超声波提取法[12]、微生物发酵法[13]等。如张静等[14]用碱性蛋白酶直接水解制备得到花芸豆多肽。周丽卿[15]采用碱溶酸沉法提取鹰嘴豆多肽获得了较好的提取效果。聂艳峰等[16]在直接酶解的基础上加入了超声辅助功能来提取多肽以达到优化的目的。牟金秀[17]采用微生物发酵法对玉米多肽进行提取,获得较高的转化率。目前,对辣木籽的研究主要集中在蛋白质提取、油脂提取、营养功能、脂肪酸组成、多糖和多酚等方面,对辣木籽多肽进行提取的报道较少。本研究选用脱脂后的辣木籽粉为原料,采用超声波辅助酶解法提取辣木籽多肽,为辣木籽功能化产品的生产提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料:脱脂辣木籽粉(广西习缘辣木有限公司),Gly-Gly-Tyr-Arg 标准品(上海麦克林生化科技有限公司);碱性蛋白酶(北京谱析标准技术有限公司);其余试剂均为优级纯试剂。

仪器:HR/T16M 台式高速冷冻离心机(湖南郝西仪器装备有限公司);KQ-300DE 数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);UV-2600紫外可见分光光度计(岛津公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的测定

参考张静等[14]关于多肽标准曲线试验的方法,取一定量由100%三氯乙酸溶液稀释成质量分数为5%的TCA 溶液,依次配制0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28 mg/mL 的Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准溶液;从10 mL 容量瓶中分别取6 mL 四肽标准溶液置于10 mL 离心管,同时加入4 mL 双缩脲试剂,借助漩涡混合器使其混合均匀,静置0.5 h 后于3 000 r/min 条件下离心5 min。测定吸光值,以肽的质量浓度为横坐标x(mg/mL),吸光值为纵坐标y,制作标准曲线。

1.2.2 工艺流程

脱脂辣木籽粉→酶解提取→灭酶→辣木籽多肽酶解液→去蛋白→多肽含量测定。

1.2.3 多肽含量的测定

将经过去蛋白的上清液转至50 mL 比色管中,用质量分数为5%的三氯乙酸水溶液定容到刻度线,摇晃使其混合。用10 mL 规格的移液枪从上述50 mL 溶液中移取6.0 mL 置于10 mL 离心管中(空白用5%TCA 代替);用5 mL 规格的移液枪移取4.0 mL 双缩脲试剂加入,混合均匀后孵育30 min。在高速离心机3 000 r/min 条件下离心5 min,取上清液于540 nm 下测定吸光值,对照Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准曲线求得所测样品溶液中多肽的质量浓度C(mg/mL),进而可求得样品中多肽的含量。

式中:y表示样品溶液中多肽的质量浓度,mg/mL;C表示标准曲线中得到的多肽质量浓度,mg·mL;n表示稀释倍数。

1.2.4 碱性蛋白酶超声辅助酶解脱脂辣木籽粉单因素研究

1.2.4.1 超声温度的确定

控制料液比为1 ∶40(g/mL)、超声功率为240 W、酶添加量为1.75%、酶解pH 为10、酶解时间为60 min,超声温度为30、35、40、45 和50 ℃时对多肽质量浓度的影响。

1.2.4.2 超声功率的确定

控制料液比为1 ∶40(g/mL)、超声功率为240 W、酶添加量为1.75%、酶解pH 为10、酶解时间为60 min、超声温度为40 ℃,探究超声功率为150、180、210、240 和270 W 时对多肽质量浓度的影响。

1.2.4.3 酶添加量的确定

控制实验过程中的料液比、超声温度、功率、酶解pH 以及时间分别为1 ∶40(g/mL)、40 ℃、240 W、10、60 min,探究酶添加量分别为0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%、2%、2.25%时,对多肽质量浓度的影响。

1.2.4.4 超声时间的确定

控制其他变量一致:料液比为1 ∶40(g/mL)、超声温度为40 ℃、超声功率为240 W、酶解pH 为10、酶添加量为2%,探究超声时间分别为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min 和70 min 时对多肽质量浓度的影响。

1.2.4.5 pH 值的确定

控制其他变量一致,料液比为1 ∶40(g/mL),设定超声波的参数为定值:温度40 ℃、功率240 W、时间40 min,酶添加量为2%。探究pH 分别为7、8、9、10、11、12 时对多肽质量浓度的影响。

1.2.5 正交试验

根据单因素实验,选出超声辅助酶解脱脂辣木籽粉效果影响较大的四个因素:超声温度(A)、超声功率(B)、酶添加量(C)、pH(D)为自变量,以多肽含量作为评价指标来确定影响的水平,设计L9(34)正交表进行优化试验(见表1)。

表1 正交试验设计

1.3 数据处理

用Origin 2021 软件处理数据绘图,正交试验用正交设计助手3.1 软件。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

根据实验结果,以Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准品绘制出标准曲线图(见图1),得到回归方程y=0.134 9x-0.000 21,R2=0.997 0。

图1 Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准曲线

2.2 碱性蛋白酶超声辅助酶解脱脂辣木籽粉最优条件筛选

2.2.1 超声温度的选择

如图2所示,温度在30～40 ℃时,由于温度的提高,可以使分子运动加快,从而使酶活性增加,多肽质量浓度呈线性上升趋势;在40～50 ℃时,多肽质量浓度呈下降趋势,这是由于蛋白酶空间结构被破坏,部分酶变性失活。碱性蛋白酶的活性受到温度的影响较大,温度太高或太低都会使酶解反应的效果变得不理想。因此,选择温度范围为35～45 ℃较适宜。

图2 超声温度对多肽含量的影响

2.2.2 超声功率的选择

如图3所示,超声功率在150～240 W 时,由于超声作用可以使分子运动加快从而使酶活性增加,多肽质量浓度呈线性上升趋势;在超过240 W之后,多肽质量浓度呈下降趋势。原因是过高的超声强度导致部分溶液受热的程度加快,破坏了多肽结构。与此同时,超声产生的空化作用使酶结构被损坏,降低了酶活力。因此,选择超声功率范围为210 ～270 W 较适宜。

图3 超声功率对多肽含量的影响

2.2.3 碱性蛋白酶酶添加量的选择

如图4所示,酶添加量为0.75%～2.25%。由于酶与底物结合的能力增大促进了酶解效果,多肽质量浓度呈稳定上升趋势;在酶添加量2%之后,多肽质量浓度呈下降趋势。原因是酶和底物的结合已经达到上限,这时过多的酶会抑制酶促效果。因此,酶的添加量在1.75%～2.25%较适宜。

图4 酶添加量对多肽含量的影响

2.2.4 超声时间的选择

如图5所示,超声时间在不断增加,酶和底物接触的面积越发充分,同时,超声的辅助蛋白酶的作用位点逐渐显露出来,促进了酶解作用,多肽质量浓度呈迅速升高趋势;在40 min 之后,多肽质量浓度呈下降趋势,原因是酶解产物的累积和过度酶解成了寡肽。因此,选择超声时间为40 min。

图5 超声时间对多肽含量的影响

2.2.5 pH 的选择

如图6所示,碱性蛋白酶的酶解性能、水解效率的提升需要适宜的碱性环境,但过高的碱浓度会使蛋白酶本体结构发生改变,使其失活。pH 会显著影响酶的活性,所以随着pH 的增大多肽产生了先增后降的质量浓度变化,在pH 为10 时表现出最好的酶解性能。因此,选择pH 的范围宜为8～10。

图6 pH 对多肽含量的影响

2.3 正交试验分析

由表2的极差值可判断出以上所选取的4 个因素都对辣木籽多肽的提取量有一定的影响。

表2 正交试验结果

其大小顺序为B＞A＞C＞D,即这几个因素中影响最大的是超声功率,其次是超声温度,再次是酶添加量,影响最小的是pH。正交实验后各因素理论最优组合为A2B2C2D3,和单因素实验做出来的最优结果一致,即超声温度为40 ℃、酶添加量为2%、超声功率为240 W、pH 为10。选用正交实验中所得的最佳组合条件进行平行验证实验,得到辣木籽多肽为9.12 mg/mL,优化方案具有一定的稳定性和可行性。

3 小结

本实验以脱脂辣木籽粉为原料,研究了超声波辅助酶解法在不同的超声条件(温度、功率、时间)、pH 和酶添加量因素下对多肽质量浓度的影响。在单因素的基础上,设计L9(34)正交试验,得到碱性蛋白酶提取脱脂辣木籽多肽的提取工艺在料液比1 ∶40(g/mL)、超声温度40 ℃、超声时间40 min、酶添加量2%、功率240 W、pH=10 的情况下,多肽质量浓度高达9.12 mg/mL。本研究可为新种类功能化的多肽制备提供新思路,可为后续多肽的纯化、多肽分子量的分布、抗氧化性等性能研究提供理论参考。