水处理中消毒对病毒灭活机理研究综述

滕宗佑 万家秀 赵培植

（1. 兰州市生态环境局榆中分局，甘肃兰州 730020；2. 兰州资源环境职业技术大学，甘肃兰州 730021）

1 引言

水传性病原体对公众健康具有重大威胁。在水处理中，病毒病原体尤其难以监测和控制，且相对于细菌等病原污染，病毒对消毒措施具有更强的抗性。因此，对消毒过程中病毒的灭活机理及其抗性发展的研究，对于水处理过程中消毒措施的确定及强抗性病毒预防追踪具有重要意义。

消毒措施对病毒的灭活作用源于基因组损伤与蛋白质损伤，病毒消毒动力学已对此深入研究，但其分子水平的灭活机制仍有探究空间。在目前阐述的常用消毒手段的机理研究中，彼此差异较大且往往互相矛盾。不同消毒灭活手段对不同结构的病毒具有不同的作用机制，同时，在过往的研究［1-3］中，研究者发现基因组、结构相似的病毒对于同一种消毒剂也可能表现出截然不同的反应［4］。消毒手段也成为病毒进化变异的重要选择压力［5］。病毒在消毒过程中，通过聚集、粘附、内化等方式增强抗逆性［6］，并在自然选择压力下使得对消毒剂具有抗性突变基因的群体成为优势种群，有助于预测不可培养性病毒株对消毒的敏感性，并对病毒抗性发展作出追踪预测，改进消毒方法［7］。

本文总结不同消毒手段对不同病毒的灭活作用及病毒对消毒灭活的抗性机理，介绍水传性病毒病原体特征及常用消毒手段、消毒操作对病毒灭活的手段及机理、病毒对消毒措施的抵抗及其抗性情况，以期为水传播病毒的消毒灭菌策略设计、病毒灭活情况预测及其抗性发展提供参考。

2 水传性病毒病原体特征及病毒的灭活机理

2.1 水传性病毒病原体特征

病毒是非细胞型微生物，具有遗传、变异、增殖、侵染等生物特征，可作为病原体引起疾病。其主要化学成分是核酸（RNA 或DNA）和蛋白质，也含有脂质和多糖。以核酸和衣壳（蛋白质外壳）作为基本结构，一些病毒中，衣壳被含脂蛋白或脂质的包膜包围。核酸可能包含一条或两条链，为病毒粒子提供传染性，而蛋白质外壳则保护其免受不利环境的影响。病毒不带有任何细胞器，无法在宿主细胞以外的环境条件中复制或长时间存活［8］。水环境中致病微生物的研究颇受重视，在消毒处理如何使细菌灭活方面已取得进展［9］，但针对病毒的详细机理及可能的病毒抗性发展研究仍不完善。因而对有关消毒处理对病毒的灭活机理进行总结很有必要。部分常见的病毒种类及其特征见表1。

表1 部分常见病毒种类及特征

2.2 消毒操作对病毒灭活的机理

目前消毒操作是灭活水体中致病性病毒的重要手段。病毒失活表现为传染性关键功能的丧失，而这常由蛋白质或基因组的改变引起［5］。病毒增殖过程中可分为三大环节：一是与宿主细胞结合（host binding）；二是基因组注入宿主细胞（genome infection）；三是基因组复制扩增（genome replication）。病毒蛋白负责介导与宿主细胞的结合和基因组注射，而完整的病毒基因组是调控宿主细胞内形成新病毒粒子的必要条件［10］。

研究显示，不同的消毒方式对于不同的病毒种类，其分子水平的作用机理并不相同。定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和定量蛋白质质谱（MALDITOF MS）是在分子水平上监测病毒基因组与蛋白质组的重要技术手段。

2.2.1 紫外线消毒

紫外线（UV）照射常被应用于水处理厂消毒中。Elbashir 等［11］的研究显示，Tulane 病毒（TV）与轮状病毒（RV）对于不同波长的紫外线敏感度不同，TV 病毒对于波长在220～254 nm 间的紫外线敏感程度相似，紫外线照射诱变了病毒基因组使之无法在宿主细胞内复制或用于合成蛋白质，并造成衣壳结合蛋白突变，使TV 病毒无法与宿主细胞结合，进而终止病毒感染；RV 则对220 nm 波长的紫外线较254 nm波长的紫外线更敏感，在220 nm 及254 nm 的紫外线照射后均未丧失与宿主细胞结合的能力，但220 nm的紫外线照射诱变了RV 病毒基因组片段，使得病毒复制受阻。另有研究表明，紫外线处理MS2 噬菌体时既对其RNA 进行转化，抑制了基因组的复制，同时损伤蛋白质，抑制其遗传物质的注入能力，Rattanakul 等［12］的研究证实了紫外线对MS2 病毒的主要处理目标是其基因组，在他们的研究中，因紫外线照射在MS2 病毒基因组上诱导随机生成胸腺嘧啶二聚体造成的基因组复制能力丧失对病毒感染性丧失的贡献率为86%。在对具有包膜的假单胞菌Phi6 噬菌体病毒的处理中，紫外线也体现出对其基因组的诱变失活，但对其作用效果不及无包膜病毒［13］。由此可以发现，具有不同基因组和衣壳结构的FV，TV，MS2 噬菌体病毒及假单胞菌Phi6 噬菌体病毒受紫外线照射失活的靶向结构并不相同，病毒蛋白质及其核酸均可能成为目标对象，但损伤强度不同。紫外线的主要作用对象是病毒基因组，且对无包膜病毒基因组作用效果较好。

2.2.2 游离氯消毒

游离氯对病毒功能结构的破坏位点也体现出种间差异性。Ye 等［13］的研究显示，Phi6 噬菌体对游离氯灭活的敏感性比无包膜病毒MS2 高30 倍，他们发现，对于具有包膜的假单胞菌Phi6 噬菌体病毒，游离氯处理后，基因组受损的病毒比例小于失活的病毒比例，脂质膜反应产物含量少且并不是常规的氧化产物，而蛋白质中与氯反应活性最高的肽的速率常数与病毒失活相近，这说明游离氯对Phi6 噬菌体的灭活是由蛋白质反应主导的而非基因组反应和脂质反应，无包膜的MS2 噬菌体病毒与游离氯的反应主要由基因组反应和脂质反应驱动，同时，Phi6 噬菌体蛋白质关键肽中甲硫氨酸残基及半胱氨酸残基的含量与蛋白质和游离氯的反应活性相关，进一步研究显示，Phi6 噬菌体蛋白质中相对较多的溶剂可及的甲硫氨酸和半胱氨酸残基，可能是其较MS2 病毒对游离氯灭活更敏感的原因。游离氯对腺病毒（HAdV）的灭活则主要作用于HAdV 完成宿主细胞结合后、在病毒早期蛋白质合成之前，HAdV 蛋白质是其主要作用位点。总的来说，游离氯可靶向作用于基因组和蛋白质，导致复制及与侵染有关的蛋白质介导功能的丧失［14］。

2.3 消毒措施对比

即使是同一病毒，不同的消毒措施其主要作用位点也不尽相同。Wigginton 等［14］发现UV 照射导致MS2 失活主要通过转化RNA 本身抑制基因组复制，同时通过降解外壳蛋白残基抑制了其遗传物质的注入能力，单线态氧（1O）2通过破坏基因组复制而导致失活；二氧化氯（ClO2）较核苷酸更易与氨基酸反应，通过选择性破坏病毒结构蛋白上的易感区使病毒失活，而基因组保持完整；游离氯对基因组损伤范围大，但引起的复制功能丧失对其整体失活的贡献低，对特异性位点的外壳蛋白的降解使得MS2 丧失基因组注入宿主细胞的能力。Decrey 的研究表明，MS2病毒的基因组是氨（NH）对其失活作用的靶点，这一作用可能是由于MS2 单链RNA 中的核糖易受碱性酯交换的影响，而相比DNA 病毒及双链RNA 病毒对氨作用更敏感。在这些研究中，并未发现对所有消毒方式都敏感的“薄弱环节”，这或许可以说明，针对病毒的灭活往往可以有多种对策。

3 病毒对消毒措施的抵抗及其抗性情况

病毒可以通过形成聚集体的方式抵抗不利环境条件，自然选择压力下的病毒进化也为其抵抗消毒措施带来的不良影响提供帮助。

病毒在废水和自然环境中通常以聚集体形式存在，但在确定灭活相应病毒所需的消毒剂剂量时通常视之为分散的病毒进行计算。Galasso 和Sharp［15］在紫外线对痘苗病毒的灭活作用研究中发现，有79%的病毒形成2～80 个粒子的聚集体，仅21%的病毒以孤立粒子的形式存在。且孤立的粒子比聚集体更易被破坏，聚集效应显著的病毒群体受紫外线影响的灭活速率比聚集现象不明显的群体慢得多。另一项研究显示，位于宿主细胞内的脊髓灰质炎病毒中，有80%的个体以聚集体形式存在［16］，表明聚集状态可能是大多数病毒在水中的存在形式。

大规模的病毒聚集体的存在，可能造成对病毒数量及病毒威胁的误判。Sharp 等［17］指出细胞培养过程中产生的大的病毒聚集体很少被发现，且难以被电子显微镜区分，进而难以估计其真实数量。另有研究显示［18］，聚六亚甲基双胍阳离子消毒剂可诱导病毒聚集体的形成，改变消毒剂的灭活动力学，使得消毒剂的作用效果被高估。研究者在消毒剂处理后的样品中发现了直径高达500 nm 的MS2 噬菌体聚集体，这样的聚集显著减少了病毒斑块单位的形成数量，表明病毒聚集体的形成可降低消毒措施的有效性，并干扰消毒效果的评估。病毒具有的较高的群体数量和变异率，增加了群体内的遗传多样性，使其能够快速进化并适应环境压力。而以水及废水处理系统为代表的基础设施，也通过不断的消毒处理成为病毒进化的驱动力［19］。MS2 噬菌体病毒在反复接触ClO2的情况下，各突变株对ClO2的敏感性不同；接触ClO2的病毒种群相比于未暴露于ClO2环境下的种群，对ClO2的易感性更低。在经游离氯处理后的水体中分离得到的柯萨奇B4 病毒，相比于实验室菌株对游离氯更具抗性，表明病毒对消毒手段的抗性具有遗传基础，且可能受到进化机制的影响［20］。

Zhong［21］等对MS2 噬菌体对ClO2产生的抗性实验表明，MS2 噬菌体对ClO2灭活的抗性具有特异性。但同样的抗性也出现在未暴露于ClO2环境的群体中，说明两种样品共同面对的有效且反复扩大种群数量的压力，在促进抗性产生的过程中起到主导作用，这有利于提高增殖能力的突变，也有利于在ClO2消毒环境下的存活。表明对消毒措施抗性的产生可能并非直接来源于消毒操作的诱导，而是受综合性环境因素的影响，抗性的发展可能是一个更加多样化和复杂的过程。

4 展望

病毒灭活不彻底为病原性病毒引发疾病留下风险，而噬菌体等病毒带来的抗性基因迁移也为人类健康留下隐患。自然界中病毒种类繁多，大部分未被人类分离培育，且易于变异，进一步探明病毒受消毒手段影响的灭活机理，在分子水平探究其灭活机制，将有助于预测非可培养病毒的消毒行为，并为之制定有效的消毒策略，促进消毒方法的改进。目前虽已有在结构组成层面对病毒灭活机理的影响研究，但不同病毒蛋白所涉及的基本功能、消毒时发生在病毒基因组及衣壳蛋白等位点的修饰对病毒的具体结构和功能产生的影响等并不明确。进一步明确不同消毒手段的靶位点及消毒剂是否作用于病毒某些重要的氨基酸仍有待阐明。未来的研究中若能确定病毒哪些蛋白质区域或基因组区域最易失活，将为病毒灭活手段的提高、水体中病原性病毒的监测提供帮助。

对病毒聚集效应的研究已有许多，但对病毒聚集体进行更多的研究，了解其在病毒抵抗不利环境条件中的作用、机理，将有助于优化废水处理系统，并为了解部分病毒对消毒措施拥有显著强于其他种类病毒的抗性提供帮助。进一步明确病毒在环境压力下的响应机理，将有利于为病毒在不良环境下的进化方向提供预判，从而获得应对不同消毒措施具有强抗性病毒的先机。