C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养、分化及两种不同品牌血清对其增殖的影响

刘剑锋，汤剑明，阳莲，程建红，李露，洪莉

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种存在于骨髓结缔组织中的基质细胞，具有广泛的增殖能力以及多向分化的潜能，是组织修复方向的研究热点[1]。目前BMSCs被广泛用于多种疾病的治疗和研究，如心肌梗死[2]、肢体缺血[3]、压力性尿失禁[4]等。目前，BMSCs提取方法有多种，包括全骨髓差速贴壁法[5]、密度梯度离心法[6]、免疫磁珠分选法[7]等。然而，BMSCs的生长增殖受多种因素的影响，其体外培养条件及方法尚无统一观点。血清是细胞培养过程中至关重要的环节，当下市面上的血清种类多样，成分、来源不同，使BMSCs的分离培养效果具有差异。本文采用贴壁培养法进行C57BL/6小鼠BMSCs的体外分离培养，选用配置10%浓度的血清培养基[8-9]，并探究在相同实验条件下含两种不同品牌胎牛血清(Yeasen血清，Gbico血清)的培养基对BMSCs细胞数量、形态以及生长周期的影响，从而为BMSCs体外分离培养的血清选择提供更加优化的方案，以服务于临床和科研。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4～6周SPF级C57BL/6雄性小鼠，体重15～20 g，由武汉大学实验动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

1.2 主要试剂

0.25%胰蛋白酶，磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清(Fetal Bovine Serum，中国，Yeasen公司，货号：40130es76),DMEM/F12 培养基(Hyclone) 、胎牛血清(Fetal Bovine Serum,美国，Gibco公司，货号：10099-141)，Cell Counting Kit-8(CCK-8) 试剂盒(武汉科瑞生物技术有限公司),台盼蓝染液(凯基生物公司)，青链霉素，兔抗小鼠CD34、44、90及106多克隆抗体(Ⅰ抗，美国Santa Cruz 产品),兔抗小鼠CD34、CD44、CD90、CD106(Ⅰ抗，Abcam公司)。Oricell C57BL/6小鼠BMSCs成骨诱导分化培养基试剂盒(Cyagen公司,货号：MUBMX-90021)，Oricell C57BL/6小鼠BMSCs成脂诱导分化培养基试剂盒(Cyagen公司,货号：MUBMX-90031)。

培养基配制：Yeasen胎牛血清组：10% Yeasen胎牛血清+89% DMEM/F12+1%青链霉素；Gibco胎牛血清组：10% Gibco胎牛血清+89% DMEM/F12+1%青链霉素。

1.3 主要仪器

超净工作台，25 cm2细胞培养瓶，六孔板，二氧化碳培养箱(中国香港，Healforce)，普通倒置显微镜、倒置荧光显微镜(日本，Olympus)，酶标仪(美国，Waltham MA)，低温离心机(德国，Eppendorf)。

1.4 小鼠BMSCs的原代分离和培养

颈椎脱臼法处死小鼠，酒精浸泡2～3 min后转移至超净工作台，组织镊剥离干净股骨和胫骨上附着的肌肉等组织(见图1)放入含10%青链霉素的PBS液中清洗3遍，剪去股骨和胫骨的骨骺端，暴露骨髓腔，用10 mL注射器吸取DMEM-12完全培养基冲洗骨髓腔，直至骨髓腔变白。随后1 000 r/min 离心含有骨髓细胞的悬液5 min，弃上清液，重悬细胞沉淀经均匀转入25 cm2细胞培养瓶里，台盼蓝染色检测其细胞活力，放入37℃、5%CO2孵育箱中培养。

1.5 实验分组

本实验共分为两组：Yeasen组：含10% Yeasen胎牛血清的DMEM/F12培养基组；Gbico组：含10% Gbico胎牛血清的DMEM/F12培养基组，36 h后首次换液，72 h后半定量换液，随后每2 d换液1次。

1.6 细胞形态学观察

倒置显微镜(100×)下，每24 h观察两组细胞培养瓶中原代细胞的生长情况和形态特征。

1.7 免疫荧光检测

采用第三代细胞进行后续实验，细胞融合达80%时传代至六孔板培养。弃去培养基，取出预先放置于6孔培养板中爬满细胞的盖玻片，PBS 冲洗3次，每次3 min；40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS 冲洗3次，每次3 min；3 g/L 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X-100)孵育30 min，PBS 冲洗3次，每次3 min；FBS室温封闭30 min，弃去，分别加兔抗小鼠CD34、CD44、CD90、CD106(1∶200)一抗4℃过夜，PBS 冲洗3 次，每次 3 min；羊抗兔IgGⅡ抗室温1 h，PBS 冲洗3次，每次 3 min;荧光倒置显微镜(400×)下观察，并统计阳性细胞数。

1.8 BMSCs诱导分化

成骨：取第3代生长良好的细胞，细胞生长至70%～80%融合时，用0.25% Trypsin-0.04% EDTA进行消化，以2×104/cm2密度均匀铺至0.1%明胶包被的6孔板中，每孔加入2 mL完全培养基。当细胞融合到60%～70%时，换用2 mL Oricell C57BL/6小鼠BMSCs成骨诱导分化完全培养基，诱导2～4周后，茜素红染色。

成脂：取第3代生长良好的细胞，细胞生长至80%～90%融合时，用0.25% Trypsin-0.04% EDTA进行消化，以2×104/cm2密度均匀铺至6孔板中，每孔加入2 mL完全培养基，当细胞融合到100%时，换用2 mL Oricell C57BL/6小鼠BMSCs成脂诱导分化完全培养基，诱导16～27 d后，油红O染色。

1.9 生长曲线绘制

采用第三代生长状态良好的原代细胞制备成单细胞悬液，血球计数板计数，调整细胞浓度为1×105个/mL，接种到96孔板，每孔100 μL，每组副孔3 个，放置于 37℃、5% CO2培养箱中培养细胞贴壁0.5 h；弃去上清，每孔加CCK-8 10 uL;在 37℃ CO2培养箱内孵育1 h，用酶标仪检测其 450 nm处吸光度。实验步骤严格按照 CCK-8检测试剂盒进行，重复4次，求其平均值，连续检测8 d，并绘制其细胞生长曲线。

1.10 统计学方法

使用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。计量资料采用单因素方差分析和t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

采用倒置显微镜分别观察原代以及传代后不同时间段(2 d、4 d、6 d)BMSCs的生长情况，结果显示，原代刚接种的BMSCs呈圆形，大小不一，悬浮于培养基中。培养2 d后细胞开始贴壁，贴壁细胞多呈梭形或多角形，出现成团生长现象。其中，Gbico组细胞较Yeasen组，成团生长现象更为明显且细胞生长密度更大。后在4 d、6 d 的倒置图像也显示出，Gbico组细胞密度明显高于Yeasen组。详见图 2。

图2 两种品牌血清培养基培养BMSCs在2 d、4 d、6 d的细胞形态(100×)

2.2 免疫荧光鉴定

在荧光倒置显微镜(400×)下观察BMSCs的表面抗原标志物CD34、44、90、106的表达。结果显示，在梭形或多角形的P3细胞的免疫荧光图像中,CD106、CD90和CD44为阳性表达，CD34为阴性表达，如图3。

图3 BMSCs 表面抗原荧光检测情况(400×)

2.3 细胞成骨、成脂诱导分化

第3代BMSCs经过成骨诱导培养基的诱导，在7 d后可见细胞形态发生变化，诱导21 d时可见多处钙结节沉积，茜素红染色阳性；成脂诱导第12天，可见多量圆形细胞，从第12～20天，圆形细胞内部有脂滴形成并逐渐增多，油红O染色可见密集红色脂滴，如图4。

图4 BMSCs成骨、成脂诱导分化(100×)

2.4 细胞生长曲线检测

通过CCK-8法分别从0 d、2 d、4 d、6 d、8 d测得细胞生长曲线，从而间接反映小鼠BMSCs的生长趋势，结果显示含10% Gbico血清与10% Yeasen血清的BMSCs都呈增长趋势，无血清培养基组细胞未见增长。相较于Yeasen组，Gbico组的BMSCs生长趋势更为显著。如图5。

图5 小鼠骨髓间充质干细胞体外培养生长曲线

3 讨论

间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是存在于骨髓腔与多个组织器官的成体干细胞，可以分化为骨、软骨、脂肪、神经等组织，具有多向分化潜能[10-12]。同时，干细胞疗法在多种组织修复的研究中表现出巨大潜力[13-15]。然而，BMSCs在小鼠骨髓中含量少、存活率低、提取困难，其体外分离培养的难度很大。常用的MSCs体外分离培养方法包括：差速贴壁法、密度梯度离心法、免疫磁珠分选法和细胞表面标志物分选法4种方法[16]。

本次实验采用差速贴壁法提取小鼠BMSCs，是一种快速、简单、经济的分选方法，根据骨髓细胞群的贴壁能力以及对胰酶的敏感程度不同，在换液以及胰酶消化传代过程中不断分离出BMSCs。在体外分离实验后，通过倒置显微镜观察到了呈梭形或多角形、团状生长的MCSCs，随着时间的推移数量明显增多。BMSCs的表型具有间充质细胞、上皮细胞和内皮细胞的特点，一般通过不表达CD14、CD34等，表达CD44、CD90、CD106等标志，对BMSCs进行初步鉴定[17-18]。本实验通过免疫荧光检测发现细胞群高表达CD44、CD90、CD106，低表达CD34。免疫荧光图片与倒置显微镜图说明了BMSCs的成功分离与增殖。同时，本实验应用BMSCs成骨、成脂分化培养基对BMSCs进行定向诱导，通过茜素红染色(+)与油红染色(+)表明了诱导的成功，进一步说明了BMSCs的多向分化能力。

BMSCs对血清、培养基等微环境敏感，体外培养需要苛刻的环境条件。目前，市面上的血清种类复杂、来源多样、成分不清，对不同细胞的培养效果差异较大[19]。KuboH等[20]在BMSCs的培育中发现，相较于自体血清，补充普通胎牛血清BMSCs的血小板减少趋势明显，更有利于其增殖。本文结合了以往的大量研究文献，选用了两种常用的特级胎牛血清：Yeasen胎牛血清和Gbico血清，以10%血清+89%DMEM/F12+1%双抗比例配置培养基，对两种培养基进行比较，以观察BMSCs在两种培养基环境中的生长状态。通过倒置图片发现，两种培养基都发生了BMSCs的生长与增殖。但是，含Gbico血清的培养基相较于含Yeasen胎牛血清的培养基，BMSCs的数目增多更为明显。并进一步通过CCK-8实验检测两组细胞以及无血清条件下的BMSCs在0、2、4、6、8d的数目，绘制了生长曲线，以观察细胞活力与生长趋势。结果显示，两种血清环境下BMSCs都表现出增长趋势，其中Gbico血清促进效果更加明显，而Yeasen血清有着更加优惠的价格。Gbico胎牛血清来自澳洲，Yeasen胎牛血清选自南美，这两种特级胎牛血清都有着低含量的内毒素与血红素，为干细胞培养提供了合适的生长环境，二者表现上的差异可能与Gbico胎牛血清能够提供与体内更加相似的环境有关。关于造成这一差异的更深层次原因，其血清内具体成分以及这些成分与BMSCs的关系如何，值得进一步探究。

本研究从BMSCs的体外分离培养、鉴定、分化等一系列过程进行了较为全面的探究。总之，不同类型的血清确实会影响到BMSCs的体外培养。通过差速贴壁法快速简便地获取该细胞，含10%Yeasen血清与10%Gbico血清的DMEM/F12培养基都适用于该细胞的体外培养。其中Yeasen血清有着更高的性价比，10%Gbico则在促进增殖方面表现更加良好。