昆虫hemocytin蛋白研究进展

王菁菁,胡宏旺,胡琼波,*

(1.华南农业大学植物保护学院,广州 510642;2.华南农业大学园艺学院,广州 510642)

昆虫在复杂的生存环境中面临捕食者和寄生者的挑战，特别是在幼虫期，体壁柔软，容易形成创口，遭受寄生者的入侵。在长期适应过程中，昆虫进化出一套独特的免疫系统(Kanostetal.,2004;Jiangetal.,2010)。昆虫依赖先天免疫抵御病原物的侵染，对入侵病原作出迅速且有效的免疫应答。虽然将昆虫免疫分为体液免疫和细胞免疫，但实际二者联合作用，精准且快速地识别并杀死入侵病原(Jiravanichpaisaletal.,2006;Sheehanetal.,2018;Eleftherianosetal.,2021)。一旦昆虫体表形成创口或免疫力下降，即面临微生物的侵染，免疫识别蛋白发现病原或异物入侵，就会迅速启动免疫反应，介导凝血、血细胞粘附、吞噬或包囊病原、合成抗菌肽，激活黑化级联反应等，在伤口处形成凝血块、促进伤口愈合、防止血淋巴外溢，在血腔中固定和清除病原(Wojda,2017;Yangetal.,2018)。

Hemocytin是昆虫血淋巴中的重要免疫因子，本质上是一种凝集素，由血细胞合成和释放，是人血管性血友病因子(von Willebrand factor,VWF)的同源蛋白，是凝血过程的关键蛋白(Sadler,1998;Springer,2014;Lentingetal.,2015)。Hemocytin能介导血细胞之间的凝集作用，促进对病原的结节作用或囊胞化作用，固定和杀灭入侵血腔的病原(Nietal.,2020)。近年来，多种昆虫hemocytin的蛋白序列和结构被鉴定，在模式昆虫家蚕Bombyxmori和黑腹果蝇Drosophilamelanogaster中对hemocytin介导的血淋巴免疫分子机理有了更深入的研究。近期，本课题组研究发现，hemocytin是一种昆虫病原真菌次生代谢物-绿僵菌素A的靶标蛋白，预示hemocytin在杀虫剂靶点和新型农药研发中有潜在价值。本文对近些年来关于昆虫hemocytin蛋白的研究进展进行综述，并对昆虫hemocytin作为杀虫剂靶点的潜能进行讨论和展望，为新型绿色农药的研发提供新思路。

1 昆虫hemocytin的蛋白结构与序列比对分析

1.1 Hemocytin的蛋白结构

目前已有多种昆虫的hemocytin蛋白序列被鉴定，普遍由3 000～4 000个氨基酸组成，是一个巨大的多结构域蛋白，例如家蚕和果蝇hemocytin分别由3 133和3 843个氨基酸组成，分子量分别为343.40和426.42 kD(Kotanietal.,1995;Gotoetal.,2001)。根据NCBI数据库中保守结构域分析结果(图1)(Luetal.,2020)，昆虫hemocytin包含多个重复排列的结构域，包括FA58C(coagulation factor 5 or 8 C-terminal),VWD(von Willebrand factor type D),TIL(trypsin inhibitor like cysteine rich),VWC(von Willebrand factor type C),CT(C-terminal cystine knot-like),C8(8 conserved cysteine residues),ChtBD2(chitin-binding domain type 2)和MUC(mucin-2 protein WxxWrepeating region)，说明hemocytin可能是一个多功能蛋白；并且hemocytin拥有多个二硫键和糖基化位点，是其作为凝集素重要的结构基础。

图1 昆虫hemocytin结构域预测Fig.1 Prediction of hemocytin domains in insects

昆虫VWD和VWC结构域与人血管性血友病因子VWF的VWD和VWC结构域同源，说明hemocytin能在昆虫中发挥凝血效应。FA58C结构域，也被称为discoidin结构域，该结构域能与细胞表面碳水化合物结合，提示hemocytin能识别外来病原物表面的模式分子，例如细菌和真菌细胞壁成分葡聚糖等，也说明hemocytin可能是一种模式识别蛋白。TIL结构域通常含有10个半胱氨酸残基，能形成5个二硫键；部分含有TIL结构的蛋白酶抑制剂能抑制微生物蛋白酶，提示hemocytin可能有抑菌作用。CT结构域能让蛋白形成尾尾相连的二聚体，是hemocytin二聚化的结构基础；GHB结构域与CT结构域功能一致。ChtBD2和MUC结构域功能未知。

1.2 昆虫hemocytin蛋白序列比对分析

在NCBI数据库中，选取家蚕、小菜蛾Plutellaxylostella、斜纹夜蛾Spodopteralitura、菜粉蝶Pierisrapae、烟粉虱Bemisiatabaci、赤拟谷盗Triboliumcastaneum、桔小实蝇Bactroceradorsalis、红火蚁Solenopsisinvicta的hemocytin的氨基酸序列，进行多序列比对。在鳞翅目昆虫中，hemocytin蛋白氨基酸序列一致性在60%以上，在不同目昆虫中hemocytin氨基酸序列一致性仅为35%左右，说明hemocytin在进化过程中可能根据环境病原物的不同，或不同昆虫hemocytin介导的免疫调节机制不同而产生了功能分化，导致亲缘关系较远的昆虫hemocytin序列相似性较小。根据图1的结构域预测也能发现，不同昆虫hemocytin结构域构成具有一定的差异，比如烟粉虱则不具有FA58C结构域，家蚕、烟粉虱和桔小实蝇不具有ChtBD2结构域等。

在碳水化合物识别结构域FA58C中(图2)，鳞翅目昆虫具有多个保守区域，而在不同目昆虫中仅存在个别保守的氨基酸，该结构域的分化可能与昆虫所处的环境、接触的病原不同有关，识别病原不同导致FA58C的序列出现分化。VWD结构域中存在于哺乳动物凝血因子VWF中，与凝血作用有关，鳞翅目昆虫VWD结构域的相似性很高，存在许多保守的序列，不同目昆虫中也存在部分保守序列，说明VWD结构域介导的凝血功能在进化中并未出现很大的分化，出现的分化可能与不同昆虫血腔免疫的组成和功能的不同有关，导致VWD介导的凝血功能有差异。在TIL结构域中(图2)，鳞翅目TIL结构域存在明显的保守区域，而不同目昆虫仅个别保守的氨基酸残基，特别是半胱氨酸残基，可能是hemocytin形成分子内二硫键或多聚体的结构基础。

图2 昆虫hemocytin蛋白结构域氨基酸序列比对Fig.2 Amino acid sequence alignment of hemocytin domains in insectsA:von Willebrand factor type D(VWD)结构域von Willebrand factor type D (VWD) domains;B:Coagulation factor 5 or 8 C-terminal (FA58C)结构域Coagulation factor 5 or 8 C-terminal (FA58C)domain;C:Trypsin inhibitor like cysteine rich (TIL)结构域Trypsin inhibitor like cysteine rich (TIL) domain.蛋白GenBank登录号和其来源物种GenBank accession numbers of proteins and their origin species:NP_001104817.1:家蚕Bombyx mori;XP_037973765.1:小菜蛾Plutella xylostella;XP_022819319.1:斜纹夜蛾Spodoptera litura;XP_015839050.1:赤拟谷盗Tribolium castaneum;XP_011204691.1:桔小实蝇Bactrocera dorsalis;XP_011156310.2:红火蚁Solenopsis invicta;XP_022121224.2:菜粉蝶Pieris rapae;XP_018902084.1:烟粉虱Bemisia tabaci.

2 Hemocytin的合成与功能

Hemocytin由血细胞合成和释放，其功能研究集中在模式生物果蝇和家蚕中，目前还处于现象发现阶段，其分子机理缺乏深入研究。

2.1 合成与分泌

Hemocytin在血细胞中合成，在其他组织器官如脂肪体或肠道中均检测不到表达。在果蝇中，hemocytin由浆细胞和晶体细胞合成，在板层细胞中不表达(Gotoetal.,2003;Leschetal.,2007)；在家蚕中，hemocytin仅在粒细胞中合成(Araietal.,2013)。Hemocytin储存在细胞的颗粒中，以脱粒的方式释放至血淋巴中(图3)。主要以二聚体形式存在，少数为单体形式(Gotoetal.,2001)。被释放的hemocytin是经蛋白酶在VWD-C8-TIL与下一个TIL间切割的成熟形式(家蚕和果蝇成熟hemocytin分子量分别为280和300 kD)，在血淋巴中呈不溶型絮状，形成纤维结构凝集血细胞与血浆蛋白。

图3 Hemocytin介导的凝血功能Fig.3 Hemocytin-mediated coagulationTG:谷氨酰胺转氨酶Transglutaminase;PPO:酚氧化酶原Prophenoloxidase.

2.2 凝血作用

昆虫具有开放的循环系统，一旦表皮破损，面临血淋巴外溢和微生物的入侵风险。凝血作用是节肢动物重要的免疫防御机制，可以迅速形成二级屏障，在限制血淋巴损失和启动伤口愈合方面至关重要(Theopoldetal.,2004;Dushay,2009;Cerenius and Söderhäll,2011)。Hemocytin是凝血过程(图3)中的重要因子，是凝血栓的主要成分，缺失hemocytin的昆虫凝血功能严重受损，不易形成凝血栓，而丧失过多的血淋巴，也更容易被微生物侵染(Gotoetal.,2003;Leschetal.,2007;Changetal.,2012)。由于昆虫体积小，血淋巴难以获取，目前初步明确凝血过程以及其中关键因子的相互作用，但是其背后的调控机理未知。凝血过程首先是血细胞的脱粒或解体，包括hemocytin的释放，导致血细胞和细胞外基质形成软凝块，负责密封伤口；其次联合酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)活化通路和谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TG)的交联作用产生硬凝块；最后血细胞紧贴血块，将其与血淋巴分离，形成结痂(Dushay,2009)。Hemocytin是软凝块形成的关键因子，形成纤维结构凝聚血细胞、其他凝血因子和细胞外基质，甚至捕获和固定微生物(Lietal.,2002;Bidlaetal.,2005)。Hemocytin能与其他凝血蛋白相互作用，固定各因子在伤口处形成凝血块，例如凝溶胶蛋白(gelsolin)、载脂蛋白(lipophorin)、储藏蛋白(storage protein)等；能与具有交联作用的蛋白相互作用，将各凝血组分交联形成硬化的凝血栓，例如PPO,TG和peroxidasin (Karlssonetal.,2004;Scherferetal.,2004;Phillips and Clark,2017)。

Hemocytin介导的凝血作用在昆虫病原真菌侵染过程中发挥重要作用。与主要通过消化道入侵的昆虫病原细菌和病毒不同，虫生真菌通过机械压力和分泌蛋白酶直接从体壁入侵至寄主昆虫血腔中，真菌一旦突破体表屏障造成创口，即面临凝血作用(Qu and Wang,2018;Islametal.,2021)。研究表明，hemocytin参与病原真菌入侵的感染性损伤凝血，比如球孢白僵菌Beauveriabassiana侵染小菜蛾的转录组研究发现，在真菌侵染的关键时刻(36 h)，小菜蛾hemocytin和其他凝血因子的表达开始上调(Vidhateetal.,2022)。

2.3 结节和囊胞化作用

当一定数量病原成功入侵至昆虫血腔中，血细胞介导的结节和囊胞化作用对病原固定和清除十分重要。以鳞翅目昆虫为例，当血淋巴中的模式识别蛋白(pattern recognition protein,PRP)识别到病原时，血细胞立即转变成粘附状态，该过程以粒细胞和浆细胞为主，血细胞层层粘附和堆叠在病原物表面，并联合黑化反应隔绝和杀死微生物(Pech and Strand,1996;Eleftherianosetal.,2021)。其中hemocytin发挥重要的凝集作用，在血细胞间形成纤维状的结构凝聚细胞。目前发现hemocytin能介导大肠杆菌Escherichiacoli、金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae和家蚕微孢子虫Nosemabombycis等多种病原入侵的结节和囊胞化作用(Araietal.,2013;Nietal.,2020)。

Hemocytin在结节和囊胞化作用中起到凝聚作用，与凝血过程中的作用一样，将各要素凝聚到一起，最后联合黑化作用隔绝和杀死病原物(图4)(Shuetal.,2016)。Hemocytin介导各种血细胞粘附至病原处，不仅能形成鞘隔离病原，还能募集血细胞中的各种免疫蛋白，如浆细胞中血淋巴蛋白酶8、丝氨酸蛋白酶同源物，类绛色细胞中的PPO等，促进结节形成以及局部黑化反应的进行，最后通过窒息作用或产生活性氧等有毒物质杀死病原(Tokuraetal.,2004;Tokunagaetal.,2021)。Hemocytin也能凝聚免疫识别蛋白如β-1,3-葡聚糖结合蛋白(β-1,3-glucan binding protein,βGRP)、肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein,PGRP)和各种immulectin，这样的机制能促进被识别病原的及时固定和清除。

图4 家蚕hemocytin介导的结节和囊胞化Fig.4 Hemocytin-mediated nodulation and encapsulation in Bombyx mori

2.4 Hemocytin的互作蛋白预测

在STRING数据库中，对黑腹果蝇Drosophilamelanogasterhemocytin蛋白互作网络预测，发现hemocytin与免疫调控、器官分化和修复等过程中的蛋白互作，提示hemocytin不仅在昆虫免疫防御中发挥作用，还参与了幼虫的发育调控(图5)。Hemocytin与tiggrin,PPO1,PPO2和peroxidasin在凝血块中共定位，其中hemocytin与tiggrin主要负责软凝块的形成，与PPO和peroxidasin交联各种蛋白成为硬凝块甚至黑化。Hemocytin与Nimrod C1互作、共定位，参与对细菌的吞噬作用。与细胞外基质重要成分蛋白papilin互作与共定位，可能在凝血过程发挥作用。还能与血细胞中特有的蛋白HEMESE共定位，可能在血细胞囊胞化过程中共同发挥作用。Hemocytin也可能与促进细胞凋亡的croquemort蛋白共定位，参与细胞吞噬作用；也可能与一种转录激活蛋白srp共定位，参与脂肪体器官的形态发生和分化。也有文献预测hemocytin还可能与unpaired 3蛋白互作，参与JAK-STAT通路调节受损的血细胞或肠道的修复。

图5 黑腹果蝇hemocytin蛋白互作网络预测Fig.5 Prediction of hemocytin interaction network in Drosophila melanogasterProphenoloxidase 1,2:分别为酚氧化酶酶原1和2，含铜氧化酶，在黑色素等色素的形成中起作用，是黑化反应过程的关键酶 Phenoloxidase 1 and 2,respectively,copper-containing oxidases,play a role in the formation of pigments such as melanin and are key enzymes in the process of melanization;Nimrod C1:参与细菌引发的免疫反应，例如吞噬作用 Involvement in bacteria-induced immune responses,such as phagocytosis;Unpaired 3:一种Unpaired家族的细胞因子，Unpaired 3在血细胞或肠损伤时被诱导，激活JAK-STAT通路调节这些组织的修复反应 A cytokine of the Unpaired family,Unpaired 3 is induced in hemocytes or in the intestine upon damage to regulate the repair response in these tissues through JAK-STAT activation;Papilin:影响细胞重组的必要的细胞外基质蛋白质，可能通过调节金属蛋白酶在器官发生过程中的作用，能非竞争性抑制前胶原蛋白酶 As an essential extracellular matrix protein that influences cell rearrangements,it may act by modulating metalloproteinases during organogenesis,and be able to non-competitively inhibit procollagen N-proteinase;Tiggrin:一种整合素α-PS2/β-PS的配体,对幼虫肌肉结构和功能起重要作用，参与翅发育过程中细胞黏附的调节 A ligand for integrin alpha-PS2/beta-PS,it is required in larvae for proper muscle structure and function,and involved in the regulation of cell adhesion during wing development;Peroxidasin:在细胞外基质硬化、吞噬过程发挥作用 Playing a role in extracellular matrix consolidation,phagocytosis and defense;Box A-binding factor:可能作为转录激活蛋白，在脂肪体器官发生中起关键作用，其结合醇脱氢酶基因的启动子特殊序列，作为末端间隙基因HKB的下游同源基因促进前、后中肠的形态发生和分化 Functioning as a transcriptional activator protein,Box A-binding factor may play a key role in the organogenesis of the fat body,it binds a sequence element found in the larval promoters of all known alcohol dehydrogenase (ADH) genes,and acts as a homeotic gene downstream of the terminal gap gene HKB to promote morphogenesis and differentiation of anterior and posterior midgut;HEMESE:血细胞特有蛋白，参与昆虫先天免疫反应，包括板层细胞分化的负调控和外源物的囊胞化反应Specific protein in hemolymph,involvement in the innate immune response,including negative regulation of lamellocyte differentiation and encapsulation of foreign target;Croquemort:一种清道夫受体B类亚家族蛋白，Croquemort在浆细胞或巨噬细胞中表达，促进凋亡细胞清除，在表皮细胞中它在吞噬体成熟、树突修剪和损伤中都起作用 A member of the scavenger receptor class B sub-family,Croquemort is expressed in plasmatocyte or macrophages and promotes apoptotic cell clearance,and in epidermal cells it plays a role in phagosome maturation in both dendrite pruning and injury.

3 小结与展望

Hemocytin介导的血淋巴免疫是昆虫重要的防御机制，其作为一种特殊的凝集素，介导的凝血作用是昆虫表皮损伤后的重要免疫屏障，也是防御从体壁直接入侵病原如真菌的高效机制，介导的结节和囊胞化是固定和清除入侵病原的重要基础。但由于昆虫体积小、血淋巴难以提取等原因，导致凝血、结节和囊胞化过程的基础研究滞后，且hemocytin蛋白分子量大、结构复杂、难以从血淋巴中纯化等原因，基础研究不深入，功能研究仅处于现象发现阶段。本课题组前期发现，一种昆虫病原真菌金龟子绿僵菌分泌的一种杀虫毒素-绿僵菌素A能靶向结合并抑制hemocytin介导的血淋巴免疫功能，提示hemocytin在杀虫剂靶点和新型农药研发中有潜在价值。

解析hemocytin蛋白三维结构对其功能研究具有重要意义，但由于hemocytin结构复杂，难以进行表达与纯化，至今蛋白结构尚未解析；虽然人VWF蛋白结构、储存和分泌方式、调控凝血机理已明确(Springer,2014;Lentingetal.,2015)，但二者免疫系统组成、蛋白同源性和介导的凝血功能差异较大，仅能为昆虫hemocytin结构解析和功能研究提供一定参考。

调控hemocytin合成的信号通路、合成和分泌过程需要被解析。Hemocytin作为一种凝集素，是否具有免疫识别功能，还是仅仅起到桥梁连接的作用。明确hemocytin介导凝血、结节和囊胞化的分子机理是昆虫血淋巴免疫研究的重要补充。前人利用生物化学和分子生物学的手段鉴定了凝血、囊胞化过程中的重要因子，包括hemocytin以及其他蛋白，但蛋白之间的相互作用和调控方式缺乏深入的研究，其中hemocytin与血细胞的互作研究是空白，hemocytin如何介导血细胞之间的连接，至今未鉴定出相关的关键因子，本课题组已开展相关研究，发现hemocytin能与血细胞骨架组成蛋白互作，似乎对血细胞有支撑作用。

天然产物-靶标模型是研发新型农药的最佳途径，发现化合物在生物体内的靶点，并从化合物-靶标的互作模式出发，研发新作用方式、新骨架的新农药(Newman and Cragg,2012;Harveyetal.,2015)。昆虫的免疫系统是一类潜在的杀虫剂靶标，与哺乳动物的免疫系统不同，昆虫主要依赖先天性免疫，其组成结构与机理两者相差远，关键蛋白同源相似性较小，基于免疫靶点设计的新药作用机理新颖，选择性好。本课题组前期发现虫生真菌毒素绿僵菌素A靶向结合并抑制昆虫hemocytin的功能，为hemocytin在害虫防治领域的应用提供了新的研究方向。例如hemocytin可作为一种新的RNAi防治害虫的靶基因，为RNAi农药提供新基因与新研究方向；深入研究绿僵菌素A-hemocytin的互作模式，并基于此筛选出更多新颖的化合物，为新农药研发提供先导药物。