灵芝杂交育种及栽培技术

吴 芳，王小艳，王春晖，李文得，姜性坚

（湖南省食用菌研究所，湖南 长沙 410013）

灵芝属担子菌门（Basidiomycota）蘑菇纲（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）灵芝属（Ganoderma）物种。依据现代分类学研究，目前常见栽培的灵芝主要有赤芝（G.lingzhi）、亮盖灵芝（G.lucidum）、中华灵芝（G.sinense）以及通过现代育种手段选育的多孢灵芝等[1-4]。随着科学技术的日益革新，近几十年来，灵芝种质资源、栽培技术及其在抗肿瘤、抗氧化、保肝、助眠等医药和保健领域的研究和应用广受关注[5-9]。作为生产与应用最为广泛的药用菌之一，灵芝存在分类地位混乱、种质资源来源不清晰，同物异名等多种现象。目前已有戴玉成教授等学者相继对灵芝的分类鉴定进行了较为全面系统的总结[10-11]，但是在灵芝种质资源评价、选育创新与利用等方面尚缺乏较为系统的研究。

单孢杂交育种能够有效将不同来源亲本的基因进行重组，而野生菌株与地方栽培品种的结合有利于筛选地方适栽的优良菌株[12-13]。这些是保障灵芝产业稳步健康发展的基础。因此，笔者采用单孢杂交育种方式，将湖南省内较优的栽培品种与中华灵芝进行杂交，经生物学特性比较、出菇试验及杂交菌株分子鉴定，选育出2株生长性状稳定、生物转化率高的杂交菌株，为丰富湖湘地区栽培灵芝种质资源、开发地方气候适宜栽培品种提供材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 亲本1为湖南省内栽培较广的商品菌株，具有菌丝生长快、朵大、菇形圆整、产量高但抗病虫害能力较弱的特点。亲本2的抗病虫害能力强，但产量较低。上述菌株均保存于湖南省食用菌研究所。

1.1.2 供试培养基及配方 母种培养基为常规PDA培养基，原种及栽培种培养基配方为木屑40%、棉籽壳40%、玉米粉18%、红糖1%、石膏粉1%，含水量60%。

1.2 试验方法

1.2.1 单孢制备与杂交 单孢杂交参照于晶等[14]的方法，分别收集亲本1和亲本2的有性孢子，进行单孢分离培养，制备孢子单核菌丝体作为杂交亲本。

1.2.2 单-双核及杂交子鉴定 显微观察检验单孢菌丝及杂交菌株，观察是否具有锁状联合，将杂交菌株与亲本置于同一培养皿培养观察是否具有拮抗作用。

1.2.3 杂交子及亲本分子鉴定 提取亲本及获得的杂交菌株的DNA，扩增ITS片段进行测序，比较分析序列碱基构成与变异，并采用UPGMA法进行系统聚类分析。

1.2.4 杂交子筛选 （1）初筛：采用PDA平板培养法，从获得的39个杂交菌株中挑选15个与亲本具有明显拮抗作用的菌株，比较观察其菌丝生长情况及培养时间。（2）复筛：挑选初筛结果中菌丝生长性状较好的5个杂交菌株，通过栽培试验进行复筛，根据当地栽培习惯，每个杂交菌株制袋100个，规格为17 cm×33 cm，每袋装干料500 g，含水量约为60%，出菇条件温度为28～32℃，空气相对湿度85%～95%。每个菌株选取20个菌包，观察记录各菌株现蕾时间，子实体颜色、质地，菌肉厚度、产孢量等生物学性状，并计算生物学效率。

2 结果与分析

2.1 杂交子获得与初筛

由图1可知，单孢培养分别获得亲本1单核菌丝10个，亲本2单核菌丝12个，两两杂交形成120个组合，通过单孢选育共获得杂交菌株39株，经显微观察均具有锁状联合。由图2可知，通过拮抗试验挑选与亲本存在明显拮抗作用的15株编号为GH01～GH15，并进行菌丝生物学特性初筛。

图1 亲本与杂交子菌丝的显微观察结果

图2 拮抗试验结果

由表1可知，15个杂交菌株中GH01、GH03、GH07、GH09、GH10菌丝生长较快，活力长势佳，且具有较低的感杂率，其他菌株存在感杂率偏高或菌丝较弱的现象。

表1 杂交子初筛菌丝生长与生物学特性

2.2 遗传关系分析

提取15个杂交菌株的DNA，扩增获得ITS序列，并采用UPGMA法进行系统聚类分析，结果如图3所示，亲本1与赤芝聚为一枝，亲本2与中华灵芝（黑芝）聚为一枝，杂交菌株与2个亲本形成独立分枝，支持率均大于95%，可信度高，且杂交菌株与亲本01号表现出相对较近的亲缘关系。

图3 基于ITS序列的系统发育分析（UPGMA法）

2.3 杂交子复筛

经菌丝生物学特性初筛，选择GH01、GH03、GH07、GH09、GH10这5株性状较优的菌株进行栽培试验。结果表明，杂交菌株更多表现为亲本1的形态性状，如菌盖颜色、产孢情况等，但杂交菌株菌柄较短；其中，GH07和GH09表现出较高的生物学转化率和产孢量，且均略高于2个亲本。总体来看，杂交菌株原基形成时间和菌盖形成时间较早，具有一定的杂交优势，但GH01、GH03菌株的生物转化率低于其他杂交菌株，且出芝比例也较低，具体原因有待进一步探索研究。

2.4 主要栽培技术

2.4.1 菌袋制作与培养 采用17 cm×33 cm×0.05 cm聚丙烯塑料袋，装料量500 g（干重）。栽培基质配方为杂木屑78%、麦麸20%、石膏粉1%、石灰1%，含水量60%，采用高压蒸汽灭菌，121℃，2 h。无菌操作接种，于恒温24℃、空气相对湿度70%～75%、遮光培养。培菌期每天通风2次，每次30 min，保持环境清洁干净，空气清新。经24～26 d培养，菌丝长满全袋后，再后熟培养7～10 d，至完全成熟。

2.4.2 开袋催蕾 当菌袋口开始吐黄水时，取下套环，揭开袋口。置于温度26～28℃，空气相对湿度80%～85%，光照100～200 lx环境条件下，培养6～7 d后，菌袋口开始现白色菇蕾，此时，应注意保温保湿，并保持空气清新，幼蕾逐渐长大，9～10 d后幼蕾顶部开始分化出黄褐色菌盖，2～3 d后再分化出菌柄至芝体成形。

2.4.3 出菇期管理 出菇环境应保持温度28～32℃，空气相对湿度85%～95%，光照强度200～400 lx。每天定时覆盖薄膜，通风透气，保持空气清新。当芝体长高至12 cm以上、菌盖直径≥8 cm时，芝体进入成熟期，此时，孢子便会从菌背面菌孔中弹射出来。为尽量减少孢子粉散失，宜用透气纱布或尼龙网布盖住，保持空气通畅，以免影响孢子弹射，当孢子粉大量弹射时，空气相对湿度降至80%左右，可采用地面洒水增湿，不能向芝体表面喷水，通气不良或湿度过大会阻碍孢子弹射。当大量孢子聚集在盖表面，形成一层1～2 cm厚的孢子粉时，可用干净毛刷或吸尘机一次性收集。收集前3 d，停止施水降低湿度。收集后，应及时晒干，阴雨天应烘干至含水量≤11%，用塑料袋密封保存。

3 结论与讨论

通过单孢杂交技术成功选育了赤芝与中华灵芝的杂交菌株，且通过筛选，获得生物学特性与产量较优的GH07和GH09杂交菌株，这2个菌株具有菌柄较短、正品率高、生物转化率高、产孢量高等特点，具有良好的市场应用与开发潜力，能够为地方灵芝种质资源提供新的选择。

表2 不同杂交菌株农艺性状比较

何桥兰[15]在赤芝与黑芝杂交的研究中，发现杂交后代在不同杂交菌株间，生物学转化率和药用成分等存在明显差异，优势并没有集中体现在同一杂交菌株上。Liu等[16]用2个商业灵芝品种进行杂交选育的研究也表明，不同担孢子萌发形成的单核菌丝，其菌丝生长，多糖、三萜等含量均具有明显差异，且杂合子栽培形成的子实体后代在生物学转化率、菌盖颜色、形状以及多糖、三萜等生物活性物质含量等方面均表现出非常显著的差异。

另外，随着分子生物学的不断发展，研究手段日新月异，真菌全基因组测序以及各种组学研究得以实现，如Chen等[17]利用新一代测序技术和光学制图技术对灵芝的基因组序列进行了研究，分析揭示了大量可能参与次生代谢与调控的基因或基因簇以及三萜和多糖类等生物活性物质的合成基因及调控表达基因，但其具体的代谢过程以及遗传发育等机理尚不明确。

该研究中，通过对亲本及杂交菌株进行ITS片段的扩增测序，能有效验证其遗传关系，但无法区分不同杂交菌株的遗传多样性，而在菌丝生长与复筛农艺性状过程中不同杂交子表现出较为显著的差异。因此，在灵芝选育栽培、药理开发等研究领域，仍需进一步从交配型基因、杂交菌株特异性，或活性成分、生理生化与杂交机理等方面深入研究与探讨[18-20]。