非创伤性股骨头坏死患者NK细胞的表型与功能

魏舒生，马帅，吴成玉，吴水芸，许克庆，陶钧

(1.安徽理工大学第一附属医院(淮南市第一人民医院)骨科，安徽 淮南 232000；2.安徽省芜湖市第二人民医院检验科，安徽 芜湖 241000)

非创伤性股骨头坏死(NONFH)是一种罕见的致残性骨科疾病，通常因股骨头细胞坏死，导致关节面塌陷最终引起髋关节破坏[1]。NONFH的病因和发病机制仍然不清楚，主要包括血运障碍、骨内压增高、脂质代谢紊乱及免疫因素等学说。NONFH典型的病变过程骨坏死发生—死骨吸收—新骨形成，在骨修复和重建过程中成骨细胞和破骨细胞之间的平衡失调，破骨细胞数量及活性均强于成骨细胞，骨的吸收大于骨的再生，最终引起股骨头塌陷变形。

免疫细胞与骨细胞有共同的起源，可直接或间接的通过RANKL/RANK/OPG通路影响骨分化，而这样的影响又与免疫细胞亚群、细胞因子和局部因素等有关[2]。研究发现T、B细胞均与NONFH相关，对NONFH的进展起到促进或抑制的作用。然而，尚未查到关于NK细胞在NONFH中的作用机制相关性研究。基于此，对比研究NONFH患者与无股骨头坏死对照组外周血及关节液中NK细胞表型变化，并测定RANKL/RANK/OPG通路表达变化，确定NK细胞在NONFH的进展过程中，起到一定的作用，丰富NONFH的免疫学机制，为早期诊断及治疗NONFH提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选择2021年2月至2021年12月于安徽理工大学第一附属医院拟行全髋关节置换术NONFH患者10例为实验组，其中男性6例，女性4例，平均年龄(64.70±13.63)岁，所有患者均符合NONFH诊断标准，且术后均行病理学检查。对照组为10例同期无NONFH病史股骨骨折患者，其中男性5例，女性5例，平均年龄(58.60±15.59)岁，并经高年资主任医师确认。排除标准：(1)髋关节细菌性感染患者；(2)类风湿患者；(3)血沉、类风湿因子以及抗“O”升高患者；(4)合并自身免疫疾病患者；(5)近2周内曾服用过非甾体类抗炎药物患者；(6)癌症患者。本研究通过安徽理工大学第一附属医院伦理委员会批准(2020-伦审-012)，所有实验对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与设备

1.2.1 试剂：FITC anti-human CD3、PE anti-human CD56、APC anti-human CD337、PerCP/Cyanine5.5 anti-human HLA-DR(人类白细胞抗原-DR)(均购自BioLend公司)，人骨保护素(OPG)ELISA检测试剂盒(上海邦奕生物)，人核因子κB受体激活因子(RANK)ELISA检测试剂盒(上海邦奕生物)，人核因子κB受体激活因子配体(RANKL)ELISA检测试剂盒(上海邦奕生物)。

1.2.2 设备：BD FACSCalibur流式细胞仪，振荡器(北京白洋医疗器械有限公司)，酶标仪(芬兰Labsystems Multiskan MS 仪器型号：352型)，洗 板 机(芬兰Thermo Labsystems 仪器型号：AC8)，离心机：微量高速离心机(国产仪器型号：TG16W)，隔水式恒温培养箱(国产仪器型号：GNP-9080型)。

1.3 实验方法

1.3.1 标本采集：(1)外周血采集：对照组及实验组外周血在获得患者本人同意后于手术日当日清晨空腹状态下采集；(2)关节液标本采集：①实验组关节液标本于手术时采集，打开皮肤及皮下组织后，在进入关节腔前以细针穿刺抽吸关节液；②对照组关节液在腰麻起效后局部严格消毒，在C臂机引导下，以腰麻包导管针穿刺抽取。

1.3.2 外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcells，PBMC)的制备：从乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)二钾盐(EDTAK2)管中抽取20 μL外周血，加入CD3、CD56、CD337及Anti-HLA-DR单克隆抗体共孵育，随后加入1 mL破红液破红，平衡液清洗多余单克隆抗体及破红液后待测。

1.3.3 关节液PBMC的制备：将关节液标本经300目滤网过滤后离心机2800 r/min离心5 min去除上清液，加入CD3、CD56、CD337及HLA-DR单克隆抗体共孵育，随后加入1 mL破红液破红，平衡液清洗多余单克隆抗体及破红液后待测。

1.3.4 流式细胞仪检测外周血淋巴细胞亚群的分布及表型特征：将待测样本顺序经BD Calibur流式细胞仪检测,采用Beckman Coulter(美国)公司Kaluza 2.1版流式分析软件进行分析。

1.3.5 ELISA检测:ELISA实验过程中设置标准品孔，样本孔，空白对照孔。具体步骤：(1)标准品：将6个水平的标准品依次加入标准品孔中，每孔各50 μL；(2)样本：在样本孔中加入样品稀释液40 μL，再加待测样品10 μL。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；(3)每孔加入酶标试剂100 μL；(4)37 ℃温育60 min；(5)弃去液体，置于洗板机中洗板后甩干，重复3次；(6)每孔先后加入显色剂A及显色剂B各50 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃下避光放置15 min；(7)各孔加50 μL终止液；(8)测定：通过空白孔进行调零，在450 nm波长处测量各孔的吸光度(OD值)。

1.4 统计学方法

计量资料以均数±标准差表示，并使用SPSS 26.0软件进行统计学分析，NONFH组和对照组之间的数据差异采用t检验进行分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NONFH组NK细胞比例增加

首先我们分别对比分析10例NONFH患者与对照组外周血及髋关节液中CD3-CD56+NK细胞的比例，与对照组相比，实验组NK细胞比例明显升高(P<0.05)，见图1A、图1C,图2A、图2C。

2.2 NONFH组NK细胞表面天然毒性受体NKp30(CD337)表达下降

为明确NK细胞是否参与NONFH病程中免疫行为，我们测定NK细胞表面受体NKp30的表达情况，对比分析发现，实验组NKp30表达较对照组明显下降(P<0.05)，见图1B、图1D、图2B、图2D。

2.3 NONFH组NK细胞表面活化分子HLA-DR表达升高

为进一步了解NK细胞在NONFH中的活化情况，我们测定表面活化分子HLA-DR表达情况，对比发现，实验组表面活化分子HLA-DR表达较对照组明显升高(P<0.05)，见图1B、图1D、图2B、图2D。

ABCD

ABCD

2.4 NONFH组NK细胞表面OPG/RANK/RANKL通路表达情况

为了解NK细胞在NONFH病程中的作用机制，通过ELISA测定两组外周血及髋关节液中OPG/RANK/RANKL的表达情况对比发现，实验组外周血OPG表达较对照组表达明显降低(P<0.05)，而关节液中表达无明显变化，RANK及RANKL表达较对照组表达明显升高(P<0.05 )见表1、表2。

表1 外周血标本RANK、RANKL及OPG对比结果

表2 关节液标本RANK、RANKL及OPG对比结果

3 讨 论

NK细胞作为天然免疫的第一道防线被人熟知，其在肿瘤、感染及自身免疫性疾病中的作用被大量研究，我们查阅到NK细胞在风湿性关节炎中促进炎症及关节破坏等相关报道，尚未查到关于NK细胞在NONFH中的作用机制相关性研究；但同样作为免疫细胞的T、B细胞均与NONFH相关，对NONFH的进展起到促进或抑制的作用；基于此，我们对比研究NONFH患者与健康对照组外周血及关节液中NK细胞表型变化，并测定RANKL/RANK/OPG通路表达变化，以探寻NK细胞与NONFH的相关性。首先，我们通过流式细胞学技术测定NONFH患者与无NONFH对照组外周血及关节液中NK细胞表型和其功能受体的表达情况，结果显示NONFH组CD3-CD56+NK细胞表达量明显高于对照组(P<0.05)，这表明NK细胞在NONFH的发生发展过程中有着重要的作用，这与之前报的NK细胞在骨性关节炎(OA)中的结果相一致[3]。NK细胞根据其表面标记物不同，可分为CD56Bright和CD56Dim两个亚群；其中CD56DimNK细胞具有很强的细胞毒性，而CD56BrightNK细胞则可以产生大量的细胞因子，如干扰素γ(IFN-γ)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)等[4]。我们的结果显示NONFH组CD56+NK细胞较健康对照组显著升高，这表明在NONFH体内NK细胞可能以分泌细胞因子的方式促进炎症反应，从而影响着NONFH的进展。

HLA-DR作为NK细胞的晚期活化标志，在健康者外周血中表达较少，而在肝脏中大量表达，当处于慢性炎症状态如人类免疫缺陷病毒引起的免疫缺陷、多发性硬化症、IgA 肾病[5]时，其表达量会显著增加；HLA-DR与其他非主要组织相容性抗原复合体II(major histocompatibility complexII，MHC-II)型分子一样，参与抗原呈递，所以其在抗原呈递细胞中高度表达，如：巨噬细胞、树突状细胞及B细胞[6]。我们的检测结果显示NONFH患者NK细胞表面HLA-DR较健康对照组明显升高，这表明NONFH体内NK细胞处于激活状态。

NK细胞在免疫过程中，无需抗原提前刺激，在自身表面抑制性及刺激性免疫受体的复杂的整合调节下与靶细胞直接进行免疫反应。激活性受体通过识别靶细胞表面MHC-I调控NK细胞活性，其主要包括天然细胞毒性受体(NCRs)(NKp30，NKp46和NKp44)，c型凝集素受体(NKG2C，NKG2D)[7]。NK细胞表面激活性受体被刺激后，可有效增强NK细胞对靶细胞的杀伤能力，因此我们对比检测了NONFH患者与对照组NK细胞表面刺激性受体NKp30的表达情况，然而，我们的结果显示NONFH组NKp30的表达较对照组明显下调，这与NK细胞在晚期肿瘤患者的免疫过程是相似的。在肿瘤早期免疫中，当靶细胞表面MHC-I表达量下降或活化性配体表达量增加，会引起干扰素及细胞因子等趋化因子的分泌增加，最终导致NK细胞NKp30表达增加、活性增强，使其以不同形式对肿瘤细胞进行靶向杀伤，其中以穿孔素/颗粒酶介导的细胞毒性作用为最有效的途径[8]。穿孔素可穿透肿瘤细胞膜，有利于丝氨酸蛋白酶进入肿瘤细胞内部分解大分子物质进而发挥其生理作用，从而引起肿瘤细胞的坏死溶解[9];在晚期肿瘤免疫过程中,肿瘤细胞似乎进化出多种逃避免疫的途径，如下调肿瘤细胞表面激活性配体的表达量、下调NK细胞表面天然毒性受体的表达量，从而达到逃避NK细胞免疫攻击的目标，近年来有多项研究证明NKp30的表达的减少程度与肿瘤严重程度呈正相关[10-11]。我们的结果同样显示NKp30在NONFH患者中表达下调，这是否说明在NONFH中是否也存在“免疫逃逸”相似的机制，有待我们进一步的研究发掘。

骨细胞坏死、吸收及新骨形成，不断的发生在NONFH的疾病过程中，但是新骨形成的速度无法与坏死吸收达到平衡，最终造成股骨头塌陷变形。RANK主要表达于破骨细胞前体、成熟破骨细胞和免疫细胞，其与配体RANKL结合后促进破骨细胞分化和成熟，OPG可以结合RANKL，抑制破骨细胞分化，这意味着上调OPG/RANKL比值可以阻止破骨细胞的发生[12]。骨保护素又称破骨细胞抑制因子，属于肿瘤坏死因子家族，研究发现局部产生的OPG对骨骼、胸腺和肠道系统稳定，起到至关重要的作用，其可抑制所有通过1,25(OH)2D3，PTH和IL-11刺激的3个不同信号通路诱导的破骨细胞形成[13]，在对骨平衡的维持中起到至关重要的作用。RANKL同样属于肿瘤坏死因子家族成员，可直接与破骨细胞祖细胞结合，对破骨细胞的分化、融合、存活和活化至关重要。免疫细胞与骨细胞有共同的起源，可直接或间接的通过RANKL/RANK/OPG系统影响骨分化，而这样的影响又与免疫细胞亚群、细胞因子和局部因素等有关[14]。2000年Arron 及Choi通过对既往研究的总结，首次提出针对骨骼细胞、免疫细胞以及相关因子和通路的骨免疫学的概念，用以阐述生理及病理状态下骨骼与免疫系统的相互作用及机制[15]。破骨细胞受到多种信号通路调控，包括RANKL/RANK/OPG通路、Wnt/β-catenin通路等,其中以RANKL/RANK/OPG通路最为重要，T、B 淋巴细胞均可通过RANKL/RANK/OPG通路调节破骨细胞的分化发育。同样，NK细胞表面也表达RANKL/RANK/OPG通路[16]，尚未见到关于NK细胞在NOFNH中的作用机制的研究。因此我们对比分析了NONFH患者与健康对照组外周血及关节液中RANK、RANKL及OPG的表达情况，结果显示NONFH组OPG表达较对照组表达明显降低，RANK及RANKL表达较对照组表达明显升高。这与早期相关性研究的结果一致[17]，这说明在NONFH的疾病发生发展中RANK/RANKL/OPG同样起到至关重要的作用。然而遗憾的是，我们并没能够将NK细胞敲除而定量分析NONFH患者NK细胞表达RANK/RANKL/OPG对其疾病发生发展的影响，这仍需我们进一步设计实验进行深入的探讨。

综上所述，我们的结果显示NONFH患者外周血及关节液中NK细胞比例明显增加，且以中CD3-CD56+NK细胞为主，同时其HLA-DR的表达量明显上调，提示在NONFH中NK细胞处于激活状态，其杀伤行为增加，加速股骨头塌陷；而NKp30表达下调，提示NONFH在病程进展过程中存在与恶性肿瘤相似的免疫逃逸情况；同时在 RANK/RANKL/OPG系统中，OPG表达明显下调，RANK、RANKL表达上调，这表明在NONFH的病程进展过程中破骨细胞处于活跃状态，骨平衡被打破，骨细胞死亡分解增加，促进骨质破坏吸收，加速股骨头塌陷。从我们的研究中可以发现，NK 细胞在NONFH患者中起到了加速疾病进展的作用，那么我们是否可以相关技术人为或药物，靶向NK细胞，降低其杀伤活性，或者上调OPG、下调RANK、RANKL的表达，抑制破骨细胞的活性，从而达到抑制股骨头中骨细胞的坏死与吸收，最终达到延缓股骨头坏死、塌陷、变形的目的。