BoBs技术快速产前诊断胎儿性染色体罕见结构异常2例

斯庭威，庄玲丹，付夏，王玉萍，王炎康，凌丽，武其文

(1.皖南医学院第一附属医院检验科遗传室；2.皖南医学院第一附属医院产前诊断中心，安徽 芜湖 241001)

性染色体病又称性染色体异常综合症，是指由性染色体(X或Y)的数目异常或结构畸变引起的疾病。人类染色体中性染色体异常，为染色体畸变的一种较常见类型，是导致性器官发育不全、第二性征及生育功能异常的重要原因，临床上患者常伴有其他脏器或功能异常和一定程度的智力低下或精神障碍等表现[1]。常见的性染色体数目非整倍体主要包括45，X、47，XXX、47，XXY、47，XYY及性染色体的嵌合型，在胎儿期的发生率高达1/435，与21三体综合征发病率接近[2-3]。性染色体结构异常多为染色体片段的缺失、重复、倒位、异位等，不同的结构异常类型导致的胎儿妊娠结局和临床症状有所差异。性染色体畸变患者的发病一般在青春期出现，影响生长发育和第二性征等。因此，在宫内对胎儿的性染色体进行产前诊断检查对预防由性染色体造成的出生缺陷具有重要意义。

细菌人工染色体标记微珠分离(BoBs)技术是一种基于液态芯片原理的用于常见染色体非整倍体和目标区域微缺失/微重复检测的分子细胞遗传学技术。由于其高通量、实验周期短的优点，已被广泛应用于21、18、13、X和Y染色体非整倍体异常以及9种微缺失综合征的快速检测[4-5]。传统的羊水穿刺染色体核型分析至少需要3～4 w才能出报告，而BoBs技术只需2～3 d即可获得检测结果。BoBs检测技术作为传统染色体核型分析方法的补充，能够缩短检测时间，减轻孕妇及其家人的焦虑，在临床产前诊断中已得到广泛应用。本文我们利用产前BoBs技术快速检测出2例孕妇胎儿性染色体结构异常病例，并对异常进行多技术平台的验证，为孕妇后续临床遗传咨询提供了实验室依据，报道如下。

1 病例资料

孕妇1：年龄25岁，孕周>22，否认不良孕史、吸烟史及遗传家族病史，来我院门诊进行常规产检，经无创产前检测(NIPT)提示性染色体非整倍体高风险，要求进行羊水穿刺，并签订染色体核型分析和产前BoBs检查知情同意书进行产前诊断。查体：孕前体健，轻度贫血貌。

孕妇2：年龄30岁，孕周>20，否认遗传家族病史。既往顺产1女，健在，孕期诊断为子痫前期，高血压，产后血压恢复正常。此次妊娠合并贫血，伴有高血压，口服拉贝洛尔，未口服阿司匹林，来我院门诊进行常规产检，经NIPT检查提示性染色体数目减少，要求进行羊水穿刺，并签订染色体核型分析和产前BoBs检查知情同意书进行产前诊断。查体：无宫缩，血压130/84 mmHg。

2 辅助检查

孕妇1羊水穿刺术前B超检查示：子宫明显增大，内见单胎，胎盘位于子宫侧壁，羊水最大径线39 mm，胎心率156次/分钟，羊水未见异常。血常规、血凝常规检查无明显异常。

孕妇2羊水穿刺术前B超检查示：子宫明显增大，内见单胎，胎盘位于子宫后壁，胎头椭圆形，羊水最大径线67 mm，胎心率157次/分钟，羊水正常。血常规检查示：白细胞10.8×109/L[正常参考值范围：(4～10)×109/L]，血红蛋白100 g/L(正常参考值范围：110～150 g/L)，余无异常。

3 分子细胞遗传学检测

3.1 BoBs检测及结果

羊水穿刺后，取羊水5～10 mL用于胎儿基因组DNA提取(QIAamp DNA提取试剂盒，Qiagen，德国)。根据制造商的说明，用产前BoBs检测试剂盒(PerkinElmer Wallac，Turku，芬兰)检测常见的13、18、21、X和Y染色体非整倍体异常和9种微缺失综合症。试验操作过程主要分为DNA标记、DNA纯化、DNA杂交、DNA洗涤以及与报告分子结合、Luminex 200(上海透景生命)上机检测。最后，使用BoBsoft 1.0软件(PerkinElmer,Wallac，Turku，芬兰)进行数据分析。产前BOBs试剂盒在X染色体上分布有5个探针结合位点(短臂3个和长臂2个)，分别位于Xp22.31、Xp22.2、Xp21.1、Xq13、Xq27。Y染色体上也分布有5个探针结合位点(短臂1个和长臂4个)，分别位于Yp11.2、Yq11.221、Yq11.222、Yq11.223、Yq11.23。孕妇1的BoBs检测结果显示胎儿X染色体短臂3个探针信号减少，可能存在Xp22.31p22.2p21.1区域缺失，见图1A。孕妇2胎儿BOBs检测Yp11.2区域信号增强可能存在片段重复以及长臂存在Yq11.221q11.222q11.223q11.23区域片段缺失，见图2A。

3.2 染色体核型分析及结果

2位孕妇均进行了羊水染色体核型分析，取羊水20 mL离心后，保留细胞悬液进行细胞培养。常规染色体制片，G显带至少观察20个染色体组，分析3～5个核型。按照国际人类细胞遗传学命名系统(ISCN 2016)进行胎儿核型的描述。孕妇1胎儿核型结果报告为46，X，del (X) (p11.4)，验证了X染色体短臂存在大片段的缺失，断裂点位于短臂p11.4，见图1B。孕妇2胎儿染色体核型结果报告为46,X,del (Y) (q11)，检出了Y染色体存在长臂大片段的缺失但短臂重复未检出，见图2B。

A：BoBs结果显示Xp21-22区域3个探针信号存在缺失(红色为与正常女性基因组信号比较；蓝色为与正常男性基因组信号比较)；B：箭头所指为X染色体短臂缺失区域，核型为46，X，del (X) (p11.4)

3.3 Y染色体微缺失及CMA检测结果

为验证孕妇2胎儿BoBs检测结果及染色体核型分析结果，在征得孕妇夫妻双方知情同意后，对胎儿羊水DNA同时进行了Y染色体微缺失以及高分辨率的染色体微阵列(chromosome microarray analysis，CMA)检测。运用多重PCR荧光探针法试剂盒(上海透景生命科技有限公司)检测位于Y染色体短臂的男性性别决定基因SRY以及位于长臂的AZFa、AZFb、AZFc这3个区域，结果显示孕妇2胎儿存在AZFb+c区域缺失，见图2C。使用含有180K寡核苷酸探针的CGX SNP v1.1芯片(PerkinElmer,Wallac，Turku，芬兰)进行染色体片段重复/缺失以及SNP检测，array芯片分析结果为：arr [GRCh37] Yp11.32q11.221 (246520_18386235)×2，Yq11.221q12 (18386235_59373566)×0，芯片结果表明Y染色体短臂存在18.14 Mb重复，以及长臂Yq11.221q12存在约40.99 Mb的完全缺失，芯片结果对孕妇2胎儿核型修正为46，X，idic(Y) (q11.221)，见图2D和E。

A：BoBs检测结果显示Yp11区域探针信号增强及Yq11C2～C5区域缺失(红色为与正常女性基因组信号比较；蓝色为与正常男性基因组信号比较)；B：箭头所指为长臂缺失的Y染色体，核型报告结果为46，X，del (Y) (q11)；C：Y染色体微缺失检测结果为AZFb+c区域缺失；D和E：羊水CMA检测结果；D为Y染色体短臂存在重复，E为Y染色体长臂存在缺失，修正核型结果为46，X，idic(Y) (q11.221)

4 讨 论

性染色体的结构异常如缺失、重复、倒位等常是由人类染色体上无规律的新发突变引起的，由于性染色体不同片段区域的功能不同，将会导致患者临床症状和遗传表现有所差异。作为染色体产前诊断的金标准，传统核型分析在检测染色体数目异常、大片段的缺失或重复等结构异常方面具有较高的检出率，但不能鉴定出小片段(<5 Mb)的亚结构性微缺失/微重复[6-7]。产前BoBs技术利用DNA探针在染色体上的分布，提高了其在常见染色体非整倍体染色体数目变异快速检出能力。我们应用的产前BOBs试剂盒在性染色体探针分布区域各有5个位点，X染色体探针区域包括Xp22.31、Xp22.2、Xp21.1、Xq13.2、Xq27.3，Y染色体探针区域包括Yp11.2、Yq11.221、Yq11.222、Yq11.223、Yq11.23。临床检测过程中一旦发现某个探针位点出现信号异常，可快速得出该区域可能存在染色体片段缺失或重复的可能。

本研究孕妇1胎儿BoBs检测结果发现Xp22.31、Xp22.2、Xp21.1 3个区域探针信号缺失，判定为X染色体短臂可能存在缺失，之后的羊水核型结果验证为46，X，del (X) (p11.4)，表明其存在X染色体短臂缺失。研究表明，Xp22.31区域的缺失导致ANOS1和STS基因的丢失，这两个基因分别与Kallmann综合征和X连锁鱼鳞病相关，通常发生在男性，发病率为1/2000到1/6000[8-9]。也有研究报道Xp22.31区域重复主要与智力、行为异常等神经认知方面的临床表型相关[10]。经遗传咨询后，孕妇及其家属选择终止妊娠。

孕妇2胎儿BoBs检测结果为Yp11.2区域重复，Yq11.221、Yq11.222、Yq11.223、Yq11.23 4个区域缺失，提示该患儿存在Y染色体短臂重复以及长臂缺失，而核型分析结果未见短臂重复，可能与核型分析的分辨率较低有关。Y染色体微缺失检测是针对Y染色体上一些与男性生殖相关的基因，如Yp11.3与睾丸发生相关的SRY基因和Yq11区域的与精子发生相关的AZFa、AZFb、AZFc 3个区域。Yq11.223及Yq11.23区域含有DAZ1、DAZ2、DAZ3等OMIM基因，位于AZFc区域，有研究表明该区域缺失是引起男性无精、少精、不育的原因之一[11-12]。为明确该患儿是否存在AZF区域缺失，本研究进行了Y染色体微缺失检测，结果显示该胎儿存在AZFb和AZFc区段联合缺失，推测该胎儿未来在精子生成方面可能会有缺陷。进一步的CMA检测验证了该患儿存在Y染色体短臂重复和长臂缺失，芯片分析结果为：arr [GRCh37] Yp11.32q11.221 (246520_18386235) ×2，Yq11.221q12 (18386235_59373566) ×0，片段大小为18.14 Mb的重复以及40.99 Mb的完全缺失，表明该样本Y染色体为等臂双着丝粒染色体，根据芯片结果修正染色体核型结果为46，X，idic(Y) (q11.221)，文献查询提示该胎儿儿可能会表现出不育、小睾症等临床特征[13]。经遗传咨询后，该孕妇及其家属选择终止妊娠。

Li[14]等研究表明，BoBs技术在检测染色体微缺失/微重复方面具有较高的准确性和可靠性，其检测结果与FISH或CMA完全一致，且相比于这些技术具有灵敏度高、高通量、经济效益高等优点。本报道中BoBs检测提示孕妇2胎儿Y染色体存在短臂重复，而传统核型分析未见短臂异常，并且Y染色体微缺失检测和CMA验证了BoBs结果的准确性，进一步说明了BoBs技术在检测染色体微重复/微缺失异常方面具有较高的灵敏度和准确度。目前关于产前BoBs检测发现性染色体结构异常(短臂或长臂缺失/重复)的研究报道并不多，临床上以Klinefelter综合征、Turner综合征等性染色体数目异常更为常见。值得注意的是BoBs由于检测技术本身的局限性，只能检测染色体的目标区域的基因变异，不能测出染色体的平衡异位、倒位、点突变、倍性变化、单亲二倍体以及甲基化改变，对于嵌合体的敏感性低，无法检出低比率的嵌合体[15-16]，仍无法完全取代核型分析，因此需要经过染色体核型分析验证，防止发生漏检，确保产前诊断结果的准确性。

综上所述，本研究我们利用产前BoBs技术快速检测出2例孕妇胎儿性染色体罕见结构异常，为孕产妇后续的临床遗传咨询提供了实验室依据。产前BoBs是一种灵敏快速的可用于检测性染色体数目或结构异常的方法，弥补了传统染色体核型分析的不足，大大提高了产前诊断的效率和准确性，为遗传咨询提供切实可靠的实验室依据，从而减少了胎儿出生缺陷的发生。