五例H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

丁小丽，李 娜，陶宏卫

（江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300）

0 引言

禽流感（Avian Influenza，AI）是禽流行性感冒的简称，是指由A型流感病毒引起的一种家禽、野鸟和部分哺乳动物发病的人兽共患传染病[1]。禽流感病毒分为高致病性和低致病性两大类，低致病病毒感染家禽后症状不明显，容易被忽视，因此得以长期、广泛的分布，周而复始的循环及变异使其不断适应当下养殖环境，进而演化成为具有耐药性及跨种属感染的新型毒株[2]。因此，在低致病性禽流感流行季节，对病毒的分离、鉴定能够正确诊断该病，从而有效地防控该病的发生。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品与毒株

笔者在苏北地区某公司合作农户鸡场采集疑似 H9亚型禽流感发病鸡群病料5份，分别为HF-1、HF-2、JT-1、JT-2、JT-3，采样时间为2022年春。

1.1.2 主要试剂

标准抗原：H9禽流感诊断抗原，由国药集团扬州威客生物工程有限公司提供。

标准抗体：H9亚型禽流感病毒特异性血清、禽流感（H5、H7 亚型）阳性血清、鸡新城疫阳性血清、减蛋综合征阳性血清，均有由国药集团扬州威客生物工程有限公司提供。

相关试剂：SuperScript™ Ⅱ Reverse Transcriptase 反转录酶及其Buffer和E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit购自OMEGA BIO-TEK公司；DL2000 Marker购自Takara 公司。

根据流感病毒H9的基因序列，设计上游引物F与下游引物R，由通用生物（安徽）有限公司合成（表1）。

表1 引物具体序列信息

1.1.4 仪器设备

单人双面净化工作台（S W-C J-1 F），购自苏州净化设备有限公司；全自动核酸提取纯化仪（Purifier32），购自济凡生物科技有限公司；基因扩增热循环仪（Genesy 96T），购自西安天隆科技有限公司；电子天平（Fall04n），购自上海菁海仪器有限公司；电热恒温培养箱（DHP-9162），购自上海齐欣科学仪器有限公司；病毒核酸提取盒，购自济凡生物科技（常州）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样本采集

样本的采样是根据鸡群的健康状况来采集，因发病死亡的鸡采集组织病料装密封袋低温保存。样本信息具体如表2。

表2 样品信息

1.2.2 样本处理

根据小学数学人教版教材的编排特点、知识发展、学生年龄的特点，从数学教材的四个领域进行分析培训，帮助教师明确每个部分学生需要形成哪种类型的基本数学活动经验等专题培训，帮助教师针对数学活动经验对教材有比较准确的认识。

采集发病或病死鸡只的肝脾肺等内脏组织，用高压灭菌的剪刀将病料充分剪碎，然后将病料装入装有三颗钢珠的5ml管内，然后按照3：2的比例加入生理盐水，用封口带缠好，放入研磨机，60Hz研磨2min重复2次。取出分装到3管2 mlEP管内，加入适量的生理盐水混匀，于-40℃冰箱中反复冻融3次。保存冻存盒中，每次使用取一支。8000rpm离心3min，取上清液。

1.2.3 病毒的分离和传代

取出之前分装到2 mlEP管内的病料液，8000rpm离心3min，在备好灭菌2 mlEP管内加入200μl的抗生素，再加入600μl的上清液，静置1h。本次有5个样品，每个样品使用3枚鸡胚接种，每个胚接种0.2ml，培养于37℃电热恒温培养箱中。每日照胚观察3次。有死胚，取出置于4℃。孵育72h后全部取出，放4℃或-20℃将鸡胚冻死，用酒精对鸡胚消毒，用镊子敲开气室，测鸡胚效价，继续接胚，传3代后收取尿囊液。

1.2.4 病毒的血凝与血凝抑制实验

1）HA实验。操作方法：准备多个一次性96孔“V”形微量反应板和100μl刻度微量移液排枪，按表3操作。

表3 HA实验操作步骤

2）HI实验。首先测抗原的效价，根据效价，配制四单位病毒；例如测得效价为29，则配制以27计算。根据样品总数，每孔需要的μl数，算出需要的四单位病毒ml数。公式计算：抗原原液*稀释倍数=所需ml数。例如，测得效价为29，则X*27=7ml，X=56，就吸取56 μl的抗原到7 ml的生理盐水中混匀。

配制好后就进行验证，结果为前凝集两孔，后不凝集两孔就可进行下步操作（见表4）。

表4 HI实验操作步骤

1.2.5 病毒PCR鉴定

PCR鉴定有着灵敏度高，特异性强，操作简便省时等优点。

1）病毒核酸的提取和反转录。在灭菌超净台里，用FineMag快速磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒32次/盒提取病毒DNA。在试剂盒里取出预封装深孔板，上下拍打使磁珠重悬，撕去封口膜，将离心后的200μl样品上清液加入20μl蛋白酶K的96孔板的第2列孔中，加完样放入核酸自动提取仪。将磁棒套插入卡槽内。选择要运行的相应程序，运行结束后将第6列的核酸样品转移到高压过的2 mlEP管中，-20℃保存。

吸取4μl的反转酶（5×HIScript ll qRT SuperMix ll）加入经过高压的单个PCR管中，吸取16μl的核酸样品，加入该PCR管中，将PCR管瞬离使管壁的液体下沉，再放入基因扩增仪中，使用反转程序（50℃作用15min、85℃作用5sec、4℃保持），反转体系为20μl。结束后取出样品，得到结果。

2）引物配制。配制引物全程冰盒上操作，引物配制体系见表5。

表5 引物配制体系

3）目的基因的PCR扩增。用反转好的CDNA为模板加入对应的引物进行PCR，见表6。

表6 PCR运行程序

DNA核酸电泳过程：

a.胶液的配制：称取1.2 g琼脂糖，量取100ml 1X电泳液，倒入烧杯中摇匀，然后放入微波炉里加热熔化颜色清亮即可。

b.胶板的制备：加入7 μl Goldview染料，而后倒入制胶模具中，20min后取出。

c.加样：5个样品每个吸7 μl加入样品孔内，再第6孔加入7μlMarker。

d.电泳：设置电压140V、电流300AM、时间25min。

e.观察和保存：凝胶电泳结束后，将胶版放入可见光透射仪内，点紫外透射预览观察有无对应的目的条带，点采集保存电泳结果。

2 结果分析

2.1 病毒分离和传代

5个病料上请接种9～10日龄SPF鸡胚，在37℃培养箱。

表7 样品接胚后死亡情况

2.2 血凝实验（HA）和血凝抑制实验（HI）

对5个样品的鸡胚尿囊液进行检测，结果见表8；用标准血清进行血凝抑制试验，结果见表9。

表8 样品接胚尿囊液HA效价

表9 样品收胚尿囊液HI效价

综上用标准血清进行血凝抑制试验，5个样品结果显示证明分离得到的病毒为禽流感病毒H9亚型。

2.3 RT-PCR 扩增结果

对5个样品RNA进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到目的条带（见图1）。经测序比对，5个基因均属于H9N2亚型禽流感病毒的基因。

图1 5株PCR扩增电泳图

3 结论

本研究通过对鸡场病例出现大批量鸡产蛋率下降、生长速度减慢、明显的咳嗽、喘鸣等呼吸道症状，结合剖检后肝脏、脾及肾出现的典型病理变化初步诊断为禽流感H9亚型。经过对疑似病例病料采集，通过鸡胚接种，HA、HI试验，PCR等方法对病毒进行分离与鉴定，得出5株均属于H9N2亚型禽流感病毒的结论，此实验方法简便、灵敏度高、特异性强。根据近年来许多病例和研究表明，以H9N2亚型为主的低致病性禽流感的大范围流行以及对养禽业产生了持续的危害。本研究密切联系我国苏北地区养禽业的生产实际，对禽流感的研究及诊断提供了参考意义，从而更好防控该病。