针刺疗法对衰老大鼠腰肌组织形态学及细胞凋亡的影响❋

林建平， 郭明玲， 金 京， 王 浩， 王诗忠， 陈少清△

(1.福建医科大学健康学院， 福州 350122；2.福建中医药大学康复医学院，福州 350122)

据统计，80%的成年人在一生中会发生腰背疼痛，多与腰部退行性病变相关[1]。其中腰部骨骼肌衰老(lumbar muscle aging,LMA)已成为腰痛发生的第一因素，常见于运动员、体力劳动、长期不良姿势、用力不当者[2]。骨骼肌衰老表现为骨骼肌质量和力量的进行性和全面性丧失，其发病机制复杂，是激素和细胞因子失衡、肌细胞凋亡、蛋白质合成与再生功能障碍等多因素综合作用的结果，其中肌细胞凋亡是其重要机制，当细胞凋亡调控失调出现过度或不充分的凋亡时，就可能诱发许多衰老相关疾病[3，4]。临床治疗骨骼肌衰老多采用营养支持疗法，而研究证实针灸治疗也对骨骼肌衰老有良好的疗效[5，6]。但目前关于针刺治疗骨骼肌衰老作用机制方面的研究仍较少，因此本研究采用D-半乳糖(D-Galactose，D-gal)建立LMA模型大鼠，观察针刺“委中”“肾俞”对衰老大鼠腰肌质量、形态学、超微结构、肌细胞凋亡率等影响，进一步探讨针刺疗法延缓腰肌衰老的可能机制。本研究通过福建医科大学伦理委员会批准(批号FJMU IACUC 2020-0038)。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

SPF级3月龄健康雄性sprague-dawley(SD)大鼠50 只，体质量(371±30)g，由福建医科大学提供，实验动物许可证号SCXK(闽)2016-0002。大鼠在温度(25±2)℃、湿度(55±5)%、明暗周期12 h∶12 h的条件下饲养，自由进食和饮水，适应性喂养1周后采用随机数字表法分为空白组、模型组、针刺穴位组、 针刺非穴组、阳性药物组5组各10 只。

1.2 主要试剂及仪器

Tunel试剂盒(货号11684817910，瑞士Roche公司)；HE染色套装(货号G1003，武汉Servicebio公司)；D-gal、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-甲硫氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸(货号分别为S11050g、S20044-25g、S20049-25g、S20042-25g、S20093-25g、S20077-100g、S20027-100g、S200123-25g、S20063-25g、S20060-25g、S20087-25g、S20082-25g，沃森生物有限公司)；一次性无菌针灸针(型号0.25 mm×25 mm，苏州医疗用品厂有限公司)；正置光学显微镜(型号Nikon Eclipse E100)日本Nikon公司；透射电镜(型号EM208)飞利浦公司。

1.3 造模方法及评定

用0.9%氯化钠溶液配置成12.5%D-gal溶液，充分搅拌均匀现配现用。除空白组外，其余4 组每日上午9 点颈背部皮下注射 12.5%D-gal (1 000 mg·kg-1·d-1)，空白组颈背部皮下注射等量0.9%氯化钠溶液作为对照，注射按无菌操作要求进行，5组均常规饲养，自由活动，每日1次，连续8周。LMA模型成功标准[7]：肌肉衰减征指数(sarcopenia index，SI)值下降，HE染色肌细胞明显萎缩，肌细胞凋亡指数增高。

1.4 干预方法

针刺穴位组自造模第29天起，穴位定位参照《实验针灸学》[8]，选取双侧“委中”和“肾俞”，以 0.25 mm×25 mm 毫针直刺，针刺深度均取6～8 mm，下午16∶00治疗，每次留针20 min，每日1次，6 d为1个疗程，间歇1 d，连续4个疗程。

针刺非穴组选取双侧“非经非穴位”(非经非穴位1：“委中”内侧旁开0.5 cm；非经非穴位2：“肾俞”与“志室”中点)，余同针刺穴位组。

阳性药物组参照Sebastiano B[9]研究，采用混合氨基酸进行灌胃干预，成年人每天8 g混合氨基酸。氨基酸组成：L-亮氨酸2.5 g、L-赖氨酸1.3 g、L-异亮氨酸1.25 g、L-缬氨酸1.25 g、L-苏氨酸0.7 g、L-半胱氨酸0.3 g、L-组氨酸0.3 g、L-苯丙氨酸0.2 g、L-甲硫氨酸0.1 g、L-酪氨酸0.06 g和L-色氨酸 0.04 g。大鼠使用量按人与动物体表面积换算的等效剂量比率(0.018)：大鼠剂量=人 g/kg×70 kg×0.018/0.2 kg=6.3×人 g/ kg 计算，每日1次，6 d为1个疗程，间歇1 d，连续4个疗程。

1.5 标本采集及处理

末次干预结束后对所有大鼠称重记录，大鼠禁食不禁水24 h后，用4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，取俯卧位固定，于大鼠背部后正中线切开皮肤，剔除皮毛、筋膜剥离双侧竖脊肌，称重并记录肌肉湿重。选取竖脊肌腰段组织，一部分放入4%多聚甲醛溶液中固定，一部分放入电镜液，另一部分标本经过液氮速冻后迅速转移，放入超低温冰箱中保存备用。

1.6 指标检测

1.6.1 大鼠体质量增长率 大鼠体质量增长率=[第n周大鼠体质量(g)-第n-1周大鼠体质量(g)]/第n周大鼠体质量(g)×100%。

1.6.2 大鼠SI值 大鼠SI值为靶骨骼肌湿重与大鼠处死时最终体质量比值，现研究多采用SI值来间接评估骨骼肌萎缩程度。本研究取大鼠双侧竖脊肌作为靶骨骼肌，SI值(g/g)=[(脊旁双侧竖脊肌湿重(g)/最终体质量(g)]×100%。

1.6.3 HE染色观察大鼠竖脊肌组织形态 大鼠麻醉后固定取材，取大鼠脊旁腰段竖脊肌组织，放入 4%多聚甲醛中室温固定48 h，石蜡固定包埋，制作成4 μm厚切片。二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，HE 染色，中性树胶封片，观察大鼠竖脊肌组织形态变化。

1.6.4 透射电镜观察大鼠竖脊肌组织超微结构 取材3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾后固定，酒精-丙酮脱水，环氧树脂618包埋剂包埋；超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色，透射电镜观察、摄影。

1.6.5 TUNEL法观察肌细胞凋亡 肌肉组织进行石蜡包埋、切片后进行脱蜡，通过滴加蛋白酶K工作液进行修复，滴加破膜工作液进行破膜。根据片子数量和组织大小，按照TUNEL试剂盒说明书进行检测，于荧光显微镜下观察并采集图像。每张TUNEL阳性切片随机选取3个高倍视野(×400)，凋亡细胞核为绿色，正常细胞核为蓝色，计数每个视野中的凋亡细胞数和总细胞数使用加权法计算肌肉细胞凋亡指数。细胞凋亡指数(AI)=(凋亡细胞核数/总细胞核数)×100%。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠体质量增长率比较

表1示，针刺干预前与空白组比较，其余4组大鼠体质量增长率均降低(P<0.05)，干预后1周至4周与空白组比较，模型组大鼠体质量增长率均降低(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，针刺穴位组、阳性药物组体质量增长率均升高(P<0.05，P<0.01)，而针刺非穴组体质量增长率差异无统计学意义(P>0.05)；与阳性药物组比较，针刺穴位组体质量增长率差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠体质量增长率比较

2.2 各组SI值比较

图1示，与空白组比较，模型组大鼠SI值下降(P<0.01)；与模型组比较，针刺穴位组、阳性药物组SI值升高 (P<0.05，P<0.01)，针刺非穴位组SI值差异无统计学意义(P>0.05)；与阳性药物组比较，针刺穴位组SI值差异无统计学意义(P>0.05)。

注: 与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01图1 各组大鼠脊旁双侧竖脊肌湿质量比(SI值)

2.3 各组HE染色比较

图2示，空白组大鼠符合正常骨骼肌组织的形态学特征，肌纤维细胞集合而成肌束，肌细胞排列整齐紧密呈多边形，大小基本一致，细胞核大部分分布在肌细胞边缘，极少位于细胞的中心部位；与空白组比较，模型组大鼠骨骼肌细胞呈现圆形化，大小不等，排列较松散，细胞间隙增大，细胞直径的差别增大，出现不同程度的萎缩；与模型组比较，针刺穴位组、阳性药物组大鼠骨骼肌纤维组织更加紧密，圆形化程度减少，肌细胞排列较为整齐，萎缩程度减少，细胞间隙减少。

图2 各组大鼠竖脊肌组织形态表现比较(HE，×200)

2.4 各组透射电镜比较

图3示，空白组符合正常骨骼肌肌节结构正常，肌浆网形态正常且无肿胀；与空白组比较，模型组虽然肌节结构较为正常，肌丝排列整齐，但肌浆网呈现明显肿胀特征且数量减少，肌浆网管出现不同程度的扩张；与模型组比较，针刺穴位组、阳性药物组肌节结构正常，肌丝排列整齐，肌浆网形态较为正常，偶见局部轻度肿胀、扩张。

图3 各组大鼠竖脊肌组织超微结构表现比较(透射电镜)

2.5 各组肌细胞凋亡指数比较

图4、5示，与空白组比较，模型组大鼠竖脊肌AI值升高(P<0.01) ; 与模型组比较，针刺穴位组、阳性药物组竖脊肌AI值降低 (P<0.01)，针刺非穴位组AI值差异无统计学意义(P>0.05)；与阳性药物组比较，针刺穴位组AI值差异无统计学意义(P>0.05)。

注：TUNEL法检测凋亡细胞，蓝色荧光为DAPI核染，绿色荧光为阳性凋亡细胞图4 各组大鼠骨骼肌肌细胞TUNEL荧光结果比较(TUNEL×400)

注: 与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01图5 各组大鼠骨骼肌肌细胞凋亡指数变化比较

3 讨论

腰骨骼肌衰老、退变是造成腰椎失稳的核心因素，引起腰痛的发生与反复发作。“腰背委中求”是目前临床治疗腰背部疾病的重要经验指南。委中为背腰两支膀胱经脉在腘窝的会合处，起疏调腰背之气的作用。现代研究发现，委中的神经投射到脊髓节段分布和腰背部肌肉的神经节段分布，在脊髓和后根神经节有相互重叠的部位，说明刺激委中与治疗腰背肌肉疾病有着密切关系[10]。肾俞为肾的背俞穴，是肾中精气输注的部位。肾为“先天之本”，主生长发育与生殖，肾虚而致衰。中医认为选取肾俞可疏导腰部经气，调和局部气血[11]。现代研究也证实，肾俞能改善免疫功能，调节激素水平，减轻氧化应激反应，是延缓衰老的重要穴位[12，13]。本实验采用D-gal建立LMA模型大鼠，观察针刺“委中”“肾俞”两穴对衰老大鼠腰肌质量、组织形态、超微结构以及细胞凋亡的影响，初步探讨针刺疗法延缓腰肌衰老的可能机制。

研究显示，D-gal致衰老模型大鼠会出现肌肉减少，导致体质量减小[14]。SI值是判定肌肉衰减的重要指标[15]。温佩彤等[16]发现，电针“肾俞”“足三里”能提高骨骼肌湿质量比。本实验结果显示，采用针刺、阳性药物干预后，大鼠体质量增长率、SI值均明显提高，表明针刺“委中”“肾俞”能提高骨骼肌质量，延缓肌肉衰减。

随着机体年龄的增长，且长期慢性炎症、线粒体功能障碍以及活性氧累积造成的氧化应激，会直接损害骨骼肌兴奋-收缩耦联系统，最终导致肌肉无力和骨骼肌衰减[17，18]。而肌肉的正常收缩功能依赖于肌浆网上Ca2+的摄取与释放平衡[19]。可见，肌浆网对于保证骨骼肌正常功能至关重要。本研究HE结果显示，针刺使骨骼肌纤维组织更加紧密，圆形化程度减少，萎缩程度减少，细胞间隙减少。进一步进行电镜观察发现，针刺可增加肌浆网数量，改善肌浆网水肿和扩张，说明针刺“委中”“肾俞”能一定程度上纠正肌浆网的异常改变，修复肌浆网的功能，延缓肌肉衰老。

细胞凋亡是机体生命活动中的重要组成部分，通过诱导衰老、有害或受感染的细胞降解，维持细胞的更新，保证正常的生理生化和免疫功能。当细胞凋亡调控失调出现过度或不充分的凋亡时，就可能诱发许多衰老相关疾病，如肌肉衰老。Kujoth GC 等[20]证实，当线粒体γ聚合酶(Polg)突变在小鼠体内积累时，会通过诱导不同组织病理性的细胞凋亡，从而进一步加速小鼠的衰老。Zhang Y[21]等也对D-gal诱导的亚急性衰老小鼠的脑组织进行了TUNEL法检测，结果显示与空白组比较，衰老组小鼠凋亡指数明显升高。此外，杨艳[22]在骨骼肌和心肌组织实验中也得出衰老组大鼠凋亡指数较空白组升高的结果。本实验结果显示，与空白组比较，模型组大鼠肌细胞凋亡率显著升高，与上述研究结果一致。针刺干预后细胞凋亡率较模型组明显下降，说明其抗衰老机制可能与改善骨骼肌细胞凋亡情况有关，可作为后续的进一步研究方向。

综上，针刺“委中”“肾俞”可减少腰椎骨骼肌细胞凋亡，促进肌浆网功能修复,改善大鼠腰骨骼肌衰老状态。