基于TLR4 信号通路探讨丹参多糖缓解LPS诱导小鼠乳腺炎症的作用机制

靳国忠，张 迪，刘 维，窦萌萌，焦玉兰,3，吴占军，史万玉,2，包永占

（1. 河北农业大学 中兽医学院，河北 保定 071000；2. 河北省兽医生物技术创新中心，河北 保定 071000；3. 瑞普生物药业有限公司，河北 保定 071000；4.河北省农林科学院 粮油作物研究所,河北 石家庄 050035）

乳腺炎是奶牛养殖中常见的疾病之一，现代研究发现奶牛乳腺炎是包括卫生条件、挤奶方式、乳房血液循环和诸多病原微生物等在内的多方面因素共同作用的结果［1］。科学的养殖和管理可以最大程度的降低由饲养方面不足引发乳腺炎的概率，抗生素可以有效的治疗由病原菌引起的乳腺炎症反应。但抗生素的长期使用和滥用会提高细菌的耐药性，抗生素还容易在动物食品制品中残留［2］。考虑到食品安全和耐药残留的问题，人们已经开始积极寻找新的治疗方法和药物以求减少抗生素的使用［3］。天然中草药及其提取物逐渐成为研究热点［4］。

LPS 是革兰氏阴性菌外膜的重要组成部分，在发病机制中经常发挥关键作用［5］。炎症过程中，LPS 的刺激会增强细胞中Toll 样受体信号通路相关因子表达。更多的研究表明，Toll 样受体4（TLR4）在LPS 诱导的炎症过程中扮演了重要的角色［6］。LPS 侵入机体后，首先与脂多糖结合蛋白（LBP）结合，形成的结合体可以更好的与CD14 分子结合，之后将LPS 快速的呈递给TLR4/MD-2 受体复合物，调节LPS 的识别［7］。TLR4 信号通路激活后，主要通过调节下游MyD88 和NF-κB 等蛋白来传递炎症的发生［8］。使用药物促进机体内清除脂多糖并调控TLR4 信号通路因子表达水平可以成为缓解炎症损伤的研究方向。

中药丹参是唇形科植物丹参的干燥块茎和根部，有活血祛瘀，凉血消痈之功效［9］。SMPs 是丹参主要的水提物之一，现代研究证实，SMPs 具有调节免疫、减轻肝脏损伤、抗肿瘤、抗氧化和抗炎等多种作用［10］。然而，SMPs 在脂多糖诱导的奶牛乳腺炎模型中的抗炎作用及其分子机制尚不清楚。本试验选取小鼠作为试验对象，研究SMPs 的日常添加对乳腺炎是否具有调节作用，探讨SMPs 调节乳腺炎的相关机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物

昆明小鼠共80 只，雌性60 只，雌性20 只，8 周龄，体重35 ～40 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司。适应性饲养1 周后按照雌性和雄性比例3∶1 合笼，提供充足的水和饲料，雌鼠怀孕后单笼饲养。分娩1 周后建立小鼠乳腺炎模型。

1.2 试剂与材料

丹参多糖（杭州正大青春宝药业有限公司）；脂多糖干粉试剂（SIGMA）；TLR4，MyD88，P65抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；MPO 试剂盒（南京建成生物工程研究所）；TNF-α，IL-6 和IL-1β ELISA 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；总RNA 提取试剂盒；反转录试剂盒；实时荧光定量PCR 引物（见表1）；免疫荧光试剂（宝生物工程（大连）有限公司）。

表1 目的基因引物序列、扩增片段长度及序列号Table 1 Target gene primer sequence, amplified fragment length and sequence number

1.3 试验设计与乳腺炎模型建立

本试验将母鼠随机分为5 组：对照组、模型组（0.2 mg/mL）、SMPs 低剂量（250 mg/kg）组、SMPs 中剂量组（500 mg/kg）组、SMPs 高剂量组（750 mg/kg）组，每组12 只。待母鼠分娩后，按照分组使用不同浓度SMPs 溶液对雌鼠进行1 周的灌胃，对照组和模型组用等体积生理盐水代替；1 周后，母鼠第4 对乳头注射LPS 进行乳腺炎造模。对照组用等量PBS 缓冲液代替。LPS 造模24 h 后，颈椎脱臼处死母鼠，取乳腺一部分使用4%甲醛溶液固定，一部分在-80℃条件下保存备用。

1.4 小鼠乳腺的组织学评价

按照石蜡切片的制作流程对4%甲醛溶液固定好的乳腺组织进行石蜡切片制作。制作好的切片进行H＆E 染色，中性树脂封片。显微镜下观察各组乳腺组织病理学变化。

1.5 小鼠乳腺组织MPO 活性及炎性因子的测定

-80 ℃冰箱中取出冻存的小鼠乳腺组织，称取适量，加入生理盐水将乳腺组织磨成10%的匀浆，在4 ℃下12 000 r/min 离心10 min，然后按照厂家说明书操作步骤，用试剂盒对MPO 活力和各炎性因子进行评价测定。

1.6 Western blot 检测小鼠乳腺组织中TLR4 信号通路变化

利用组织蛋白提取液提取乳腺组织内蛋白，用BCA 蛋白检测试剂盒检测总蛋白浓度。将各组小鼠乳腺组织中总蛋白浓度调至同一水平，蛋白样品用10% 的SDS-PAGE 分离，随后转移到PVDF膜上，并在5%脱脂牛奶中封闭。随后，特异性一抗GAPDH、TLR4、MyD88 和p65 在4 ℃下孵育PVDF 膜过夜。室温下用 TBST 洗涤3 次，每次5 min，然后使用特定二抗抗体孵育PVDF 膜2 h 后暗处进行显色操作。

1.7 RT-qPCR 检测各组小鼠乳腺组织中TNF-α，IL-6 和IL-1β 的mRNA 表达水平变化

按照总RNA 提取试剂盒的说明在无菌无酶的条件下使用经高压的器械严格操作进行总mRNA 的提取，测定和调整浓度后进行反转录操作。使用反转录获得的cDNA，按照实时荧光定量PCR 说明书操作进行各因子的mRNA 水平检测。

1.8 数据分析

所有数据均以平均值±SEM 表示。这些数据通过GraphPad Prism7 (Manufacturer, La Jolla, CA,USA)采用单因素方差分析和Tukey 多重比较检验进行分析。

2 结果与分析

2.1 丹参多糖对各组小鼠乳腺组织中炎症发生程度的影响

空白对照组小鼠乳腺组织结构完整清晰，细胞核清晰可见且排列有序，代表腺泡结构完整没有病理损伤。模型组乳腺组织中出现大量炎性细胞浸润，腺泡边界模糊难以观察，乳腺组织结构变形被破坏，乳腺组织发生严重炎症反应。SMPs 低剂量组乳腺组织中炎性细胞浸润减少，腺泡结构比较清晰。SMPs中剂量组乳腺组织内炎性细胞浸润程度显著减轻。SMPs 高剂量组乳腺组织中基本无炎性细胞浸润，整体更趋近于健康状态（见图1）。

图1 SMPs 对乳腺炎小鼠乳腺组织病理学变化的影响Fig. 1 Effect of SMPs on mammary histopathological changes in mastitis mice

2.2 丹参多糖对小鼠乳腺组织内MPO 活性和促炎因子表达水平的影响

在造模24 h 后，各组小鼠乳腺组织内MPO 活性和促炎因子表达水平发生不同变化（见图2）。与空白对照组相比，小鼠乳腺组织内髓过氧化物酶（MPO）活力与炎性因子TNF-α，IL-1β 和IL-6的表达水平较对照组显著上升（P＜0.01），而与模型组相比，SMPs 各剂量组小鼠乳腺组织中MPO活性和炎性因子表达水平与模型组相比显著下降（P＜0.01），且呈一定的剂量依赖性。

图2 SMPs 对小鼠乳腺组织中MPO 及炎性因子表达的影响Fig. 2 Effects of SMPs on MPO and inflammatory factors expression in mouse mammary tissue

2.3 丹参多糖对小鼠乳腺组织内TLR4 炎症信号通路蛋白表达水平的影响

炎症发生后，不同组别小鼠乳腺组织内TLR4信号通路中蛋白表达水平出现差异（见图3）。与空白对照组相比，模型组TLR4 通路关键蛋白TLR4、MyD88 和NF-κB 表达水平显著上升。与模型组相比，SMPs 低、中、高剂量组中TLR4 蛋白表达水平出现显著降低，且剂量越高降低趋势越显著。在MyD88蛋白表达水平上，SMPs 低剂量组中MyD88 蛋白表达水平与模型组之间变化不显著，SMPs 中、高剂量组MyD88 蛋白表达水平均有显著下降。SMPs 低、中、高剂量组中NF-κB 蛋白表达水平与模型组相比均有显著降低。

图3 SMPs 对小鼠乳腺组织中TLR4 信号通路中关键蛋白表达的影响Fig. 3 Effects of SMPs on key protein expression in TLR4 signaling pathway in mouse mammary tissue

2.4 丹参多糖对小鼠乳腺组织内TNF-α，IL-6 和IL-1β mRNA 转录水平的影响

为了验证炎性因子mRNA 表达水平是否受到调节，采用RT-qPCR 法检测因子TNF-α，IL-1β 和IL-6 mRNA 在乳腺组织内的表达水平。如图4 所示，LPS 刺激显著上调了乳腺组织中TNF-α，IL-1β和IL-6 因子mRNA 表达水平（P＜0.01）。与模型组比，SMPs 各用药组组内TNF-α，IL-1β 和IL-6 mRNA 表达水平有不同程度的显著下降（P＜0.05或P＜0.01）。

图4 SMPs 对小鼠乳腺组织中TNF-α，IL-1β 和IL-6 mRNA 转录水平的影响Fig. 4 Effects of SMPs on mRNA transcription levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in mouse mammary tissue

3 结论与讨论

在炎症发生过程中，组织内炎性因子表达水平会发生明显变化，据报道，TNF-α，IL-6 和IL-1β等促炎因子表达水平在乳腺组织炎症中显著上升［11］，有研究指出， IL-1β 的产生会加重组织的损伤程度，通过调控IL-1β 的产生可以改变机体对损伤的抵抗能力［12］。有研究表明， IL-6 的相应抗体或阻断剂，可以用来治疗关节炎［13］。本研究发现，模型组炎性炎因子TNF-α，IL-6 和IL-1β 的表达水平较空白对照组显著上升，SMPs 各剂量组乳腺组织中炎性因子的表达水平与模型组相比明显下降。这说明SMPs 的使用降低了炎性因子的表达水平，在一定程度上减轻了炎症对乳腺组织的损伤。

TLR4 受体在LPS 诱导的炎症中活化表达，之后通过一定的复合物二聚体可以激活MyD88 依赖途径，进一步调控转录因子NF-κB 的表达，最终形成一条完整的炎症传递链条［14］。为了阐明丹参多糖的抗炎机制，采用Westen Blot 法检测TLR4 信号通路中关键蛋白TLR4,MyD88 和NF-κB 的表达水平，结果显示，这些蛋白表达水平在炎症过程中显著上升。众多研究中，Zhou Ershun 等人使用封花素（CEP）抑制了NF-κB 因子在乳腺炎小鼠模型中的活化，从而实现了药物的抗乳腺炎作用［15］。Xingxing Chen 等人进一步探究了药物荷花碱（Nuciferine）是通过抑制TLR4-NF-κB 信号通路来改善LPS 诱导的乳腺炎症［16］。卢劲晔等人采取NLRP3 抑制剂预处理，可以减轻大肠杆菌所致的乳腺组织损伤并且降低炎症小体表达［17］。Maiju Rinne 等人阐释了米托蒽酮、吡哌酮和米托蒽酮（2 羟乙基）哌 嗪（Mitoxantrone, pixantrone and mitoxantrone（2-hydroxyethyl)piperazine）等药物在拮抗TLR4 受体方面的机制，这些药物可以通过拮抗TLR4 进一步达到抑制NF-κB 激活和TNF-α 生成的作用［18］，这说明抑制信号通路中关键蛋白表达可以减轻炎症。并不是所有的药物都通过MyD88 依赖途径来调节炎症，在试验中也对SMPs 的具体作用路径进行探究［19-20］。本试验表明，SMPs 抑制了TLR4,MyD88和NF-κB 蛋白在LPS 诱导的小鼠乳腺组织炎症中的表达水平，说明SMPs 可能是通过MyD88 依赖途径来调控TLR4/NF-κB 信号通路以达到保护乳腺组织的作用。

乳腺组织在炎症发生时，促炎因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6）的mRNA 转 录 水 平 会 上 升，这 与宿主防御系统的免疫应答有关［21］。黄永周等人使用栀子苷治疗患乳腺炎的小鼠，检测结果显示小鼠乳腺上皮细胞中炎性因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 的mRNA 转录水平下降［22］。本试验中模型组的促炎因子mRNA 水平显著上升，用药组的水平呈剂量依赖性下降，这直观的说明了SMPs 在乳腺组织中可以发挥抗炎作用。

综上所述，SMPs 可以通过抑制TLR4 信号通路相关蛋白的表达来调节炎症；同时还可以抑制组织内促炎因子的表达来缓解炎症对乳腺组织的损伤。SMPs 可以成为预防奶牛乳腺炎的潜在药物。