岩藻多糖的纯化工艺研究

李莉，武成刚，李炎锴，王柯，张淑平

(上海理工大学 材料与化学学院，上海 200093)

岩藻多糖为天然的褐藻多糖硫酸酯，是一种聚合高分子电解质[1]。多项研究结果表明，岩藻多糖具有降血脂、抗凝血、抗氧化、抗肿瘤等生物活性，在海洋药物开发等领域具有巨大的潜力[2-4]。经过回收提取后的褐藻糖胶粗品中往往会含有部分杂质,如K+、Na+、Ca+、Mg+等阳离子及色素等，影响褐藻糖胶的纯度并且不利于进一步的深度开发。目前分离纯化的方法有膜分离法、树脂吸附法、电渗析等。朱家庆等采用大孔树脂法纯化葛根多糖，纯化后的多糖纯度达到55.34%[5]。Tang等采用膜分离技术纯化Lentinus edodes水提物中的多糖，得到的总糖含量最高可达86.11%[6]。本实验以岩藻多糖粗品为原料，利用阳离子树脂静态脱盐，并结合膜过滤系统对岩藻多糖进一步纯化，为研究开发岩藻多糖提供依据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

离子交换树脂(001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂)由上海华羚树脂有限公司提供；浓硫酸、苯酚、过氧化氢均为分析纯；岩藻多糖(由海带中制备，粗品含量15%以上)。

JS-XS-T-02C-01膜过滤实验设备；膜(截留分子量为300的纳滤膜)由江苏久吾高科技股份有限公司提供；HY31-01型电热恒温水浴锅；UV-1600型紫外可见分光光度计；PHS-3C型pH计；DDS-307型数字电导率仪；NDJ-5S数字式粘度计；RE-201旋转蒸发器；DZF-6030A型真空干燥机；SXL-1216型程控箱式电炉。

1.2 实验方法

1.2.1 岩藻多糖粗品的预处理 称取约1.3 kg固体样品，加入15倍固体量的去离子水溶解，取上清液进行实验。

1.2.2 阳树脂静态法脱盐[7]

1.2.2.1 阳树脂的筛选 当分离无机阳离子时一般选用阳树脂，不同类型的阳树脂其结构参数见表1。由于岩藻多糖呈弱酸性，应在酸性条件下被吸附，强酸型阳离子交换树脂主要含有强酸性的反应基如磺酸基(—SO3H)，可以用于交换所有的阳离子。而强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂中001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂常用于制药制糖工业，所以本实验主要采用001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂来进行静态法脱盐。

1.2.2.2 阳树脂的处理 用水将树脂充分膨胀后使用70～80 ℃的热水反复清洗，采用酸-碱-酸的方式将阳树脂进行活化处理，再用去离子水将树脂洗至中性，待用。树脂长期使用会被不同程度的污染，需根据情况对树脂进行不定期处理。

1.2.2.3 脱盐 量取5 L上述液体，按料液比为0.25∶1，0.5∶1，0.75∶1，1∶1等加入处理好的阳树脂进行脱盐，并不停搅拌，使离子充分交换。每隔15 min 测定液体的电导率、pH值、粘度、密度，确定阳树脂的最佳添加量。

表1 树脂的结构参数Table 1 Structural parameters of resin

1.2.3 过氧化氢脱色[8]将上述脱完盐的多糖溶液，采用过氧化氢法进行脱色。在单因素实验的基础上确定了最佳的实验参数为：过氧化氢的添加量为8%，60 ℃水浴，每隔1 h测定吸光度值，确定最佳脱色时间和计算脱色率。

1.2.4 纳滤[9]将上述多糖溶液继续纯化，采用膜分离系统。

1.2.4.1 膜的筛选 粗多糖中具有很高的盐含量，采用纳滤工艺对多糖进行浓缩时，膜材料和截留分子量的选择十分关键。首先关于材料主要选用芳香聚酰胺类纳滤膜，截留分子量的大小应确保有效组分多糖的全部截留，同时又能保证多糖中盐分的透过，降低运行压力等。本实验主要选用截留分子量为300的纳滤膜，可以很好地保留糖类，去除杂质。

1.2.4.2 膜的预处理 将膜清洗后，加入去离子水实验，达到表2条件方可使用。

表2 纳滤膜使用条件Table 2 Conditions of use of nanofiltration membranes

1.2.4.3 过纳滤膜 将岩藻多糖溶液倒入不锈钢桶内，加入1倍体积去离子水，按操作要求开启机器。加入去离子水后约5 min测定滤出液的pH、电导率和桶内液体温度。当桶内液体体积为原先体积的1/2时(约40 min)，加入1倍体积去离子水。直至加入去离子水，滤出液的电导率相对稳定时，结束实验。为防止桶内液体温度过高，适时加入冰袋降温，控制温度在45 ℃以内。

1.2.4.4 纳滤膜污染与清洗 在膜分离过程中因为多糖和杂质的影响纳滤膜会出现一定程度的污染，按技术要求清洗机器，达到表2要求方算清洗干净。

1.2.5 干燥样品 取出样液用旋转蒸发器浓缩至约1 L，加入乙醇沉淀，静置一夜。取出沉淀先用鼓风干燥去除大部分乙醇后，再真空冷冻干燥制得样品。

1.2.6 分析方法

1.2.6.1 岩藻多糖含量的测定[10]使用苯酚-硫酸法测定，以葡萄糖做标准曲线，其中回归方程为y=37.829x-0.013 4，r2=0.995 5。

1.2.6.2 脱色率的计算 以蒸馏水作为空白对照，测定溶液色度。

式中p1——脱色前溶液的吸光度值；

p2——脱色后溶液的吸光度值。

1.2.6.3 电导率的测定 采用数字电导率仪测定。

1.2.6.4 pH的测定 采用pH计进行测定。

1.2.6.5 粘度的测定 采用数字式粘度计进行测定。

1.2.6.7 水分测定[11]取干净的称量瓶称取一定样品放入烘箱中，在一定的温度(95～105 ℃)和压力(常压)下加热干燥样品，蒸发掉样品中的水分，称量样品干燥前后的质量，质量差即为样品的水分含量。计算公式为：

式中m0——称量瓶的质量，g；

m1——称量瓶和样品的质量，g；

m2——称量瓶和干燥后样品的质量，g。

1.2.6.8 灰分测定[11]用灼烧至恒重的坩埚称取一定样品，将样品完全炭化后于500～600 ℃高温炉中灼烧，样品中的碳、氢、氧、氮等元素以二氧化碳、氮氧化合物及水分等形式而放出，无机物则会以无机盐和金属氧化物的形式残留下来，残留下来的物质即为样品中所含灰分，称量残留物的质量以计算样品中总灰分的含量。计算公式为：

步骤4：进行特征值分解，然后依据信号子空间和噪声子空间的正交性，进行谱峰搜索，最终得到DOA估计结果.

式中m1——坩埚的质量，g；

m2——样品和坩埚的质量，g；

m3——残留物和坩埚的质量，g。

2 结果与讨论

2.1 阳树脂脱盐效果

由于海洋生物制品含有较多的Na+、Mg2+等阳离子，影响其纯度，进而影响其生理活性，因此需要将杂质离子除去。本实验采用阳离子交换树脂，可以交换阳离子物质。

R-X--Y++A+⟺R-X--A++Y+

其中，R代表离子交换剂的高分子聚合物基质，X-代表阳离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团，Y+代表阳离子交换剂的平衡离子，A+代表溶液中的离子基团[12]。

由于一个H+交换一个Na+，两个H+交换一个Mg2+，因此，溶液中离子浓度降低，又由于电导率可以反应溶液中的离子浓度；同时，H+交换下Na+、Mg2+等阳离子进入溶液，使溶液的pH值下降，所以可以根据溶液电导率和pH值的变化情况来判断离子交换过程和脱盐效果。又由于离子交换树脂交换离子的同时还可以吸附溶液中的色素和其他杂质，使溶液粘度和密度有所下降，因此本实验采用测定溶液粘度和密度的方法辅助判断阳树脂脱盐的过程和效果。

由表3可知，加入阳离子交换树脂后溶液的pH值显著下降，这是由于大量的H+进入到溶液中。电导率虽有所下降，但下降得不明显，这是由于一个H+交换一个Na+，两个H+交换一个Mg2+，对于离子浓度影响不是很明显。从粘度和密度数据可知，此两个指标也呈下降趋势。观察料液比数据，随着阳离子树脂的加入，各指标下降趋于缓慢，说明脱盐过程已趋于结束。由于处理树脂的过程复杂且需要大量去离子水，从节约方面考虑，可以选择0.75∶1为最佳料液比。

表3 阳树脂脱盐各指标测定结果Table 3 Determination results of each index of cation resin desalination

2.2 过氧化氢脱色效果

过氧化氢脱色主要因为过氧化氢带有过氧键，过氧键断裂而生成的过氧自由基夺电子能力强，有强氧化性。因此过氧化氢与色素作用时，有色物质的分子被氧化褪色，从而可以起到脱色作用[13]。

图1 过氧化氢脱色效果图Fig.1 Hydrogen peroxide decolorization effect diagram

由图1可知，加入过氧化氢后，溶液的色度下降，尤其在前2 h内最为明显，在6 h时趋于稳定，此时的脱色率为50.95%。

2.3 纳滤效果

膜过滤是一种与膜孔径大小相关的，以膜两侧的压力差为推动力的筛分技术，以膜为过滤介质，在一定的压力作用下，原液中的水和小分子等通过膜表面上微小的孔隙而成为透过液，原液中体积大于膜表面微孔的物质留在膜的进液侧，成为浓缩液，通过膜过滤技术可以实现对原液的分离和浓缩[13]。本实验采用纳滤膜进行脱盐。

由表4可知，滤出液电导率随着脱盐实验的进行而降低，当加入11倍体积样液去离子水时，滤出液电导率趋于稳定，可视为脱盐结束。温度和流量的记录是为了纳滤系统的正常运行。

脱盐前后样液的电导率从25.08 mS下降到5.32 mS，pH从2.89上升至4.04，脱盐率达到78.79%。

表4 纳滤实验各指标记录Table 4 Records of each index of nanofiltration experiment

2.4 样品各指标的测定

对纯化得到的岩藻多糖样品指标进行测定，结果见表5。纯化后样品的总糖含量为47.41%，水分含量为8.12%，灰分含量为25.09%，浓度为2.011 mg/mL 的样品溶液pH值为5.69，电导率为0.31 mS。

表5 样品各指标测定结果Table 5 Determination results of each index of the sample

3 结论

(1)过氧化氢脱色是相对温和的脱色方法，其脱色效果好，可适用于实验室大量样品的脱色。

(2)本实验采用阳离子交换树脂进行脱盐的同时，树脂对色素及其他杂质也有一定的吸附作用，纯化作用明显。

(3)膜分离技术只用压力作为膜的推动力，分离装置简单，易于操作，同样适用于实验室大量样品的纯化。其中，膜是技术关键，可根据实验要求，选择不同类型和规格的膜。本实验采用传统的树脂脱盐与先进的膜分离技术相结合，能更好地除去样品中的杂质，并且适用于其他多糖的分离纯化。

(4)通过此纯化工艺得到的岩藻多糖纯品，其多糖含量为47.41%，水分含量为8.12%，灰分含量为25.09%，浓度为2.011 mg/mL的样品溶液其pH值为5.69，电导率为0.31 mS。