捻转血矛线虫Hc-dhs-28蛋白结构和B细胞抗原表位预测

焦万明 ，马 园 ，尹衍峰 ，付 伟 ，贾晓晴 ，马俊杰 ，丁玉林 ，杜 山 ，王 瑞 *

（1.内蒙古阿拉善盟额济纳旗动物疫病预防控制中心，内蒙古 阿拉善 735400；2.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010010；3.济南市长清区畜牧兽医事业发展中心，山东 济南 250399）

捻转血矛线虫病（Haemonchosis）是一种由圆线目（Strongylata），毛圆科 （Trachostrongylidae），血矛属（Haemonchus）的捻转血矛线虫（Haemonchxs contortus）引起的寄生虫病[1]。捻转血矛线虫是一种小反刍动物的寄生线虫，分布于世界各地，以寄主血液为食，可导致动物严重贫血甚至死亡[2]。目前，使用胃肠驱虫药仍是针对该病的首选治疗手段，但是由于耐药情况日益严重，迫使我们急需开发新的药物或者更好地改进防控策略，如研制寄生虫疫苗、加强饲养管理等[3]。

近年来，针对寄生虫病基因工程疫苗的研究已成为热点，其中选择合适且能够刺激机体产生免疫反应的抗原蛋白是关键因素之一。目前，针对捻转血矛线虫病研制的重组抗原疫苗所进行的免疫试验均未取得理想效果[4]。新发现的Hc-dhs-28蛋白是Ce-dhs-28蛋白的同系物，Ce-dhs-28蛋白是氧化循环中的关键酶，该蛋白质含有短链脱氢酶结构域和过氧化物酶体靶向信号。研究发现Hc-dhs-28蛋白最有可能作为第3种3-羟酰基辅酶A脱氢酶参与过氧化物酶体脂肪酸B的氧化，从而调节与滞育相关的信息素的产生，进而影响捻转血矛线虫的滞育形成[5-6]。

本研究利用生物信息学工具及在线分析软件对Hc-dhs-28蛋白的理化性质、结构和功能等进行分析，进而确定Hc-dhs-28抗原的B细胞表位，为捻转血矛线虫病的进一步免疫诊断和疫苗研制提供参考信息。

1 材料与方法

1.1 目的基因信息

在GenBank上获取捻转血矛线虫Hc-dhs-28基因序列，编码438个氨基酸（序列号：AVP73885.1）。

1.2 试验方法

蛋白质理化性质分析：通过Expasy软件中Protparam在线工具分析蛋白质基本理化性质[7]。跨膜结构域、亲疏水性和信号肽预测：采用TMHMM Server v.2.0、Signa1P4.1Server和 ProScale在线工具对蛋白跨膜结构域、亲疏水性和信号肽进行预测[8-9]。磷酸化和亚细胞定位预测：通过NetPhos和PSORT Ⅱ在线工具对蛋白质的磷酸化位点和亚细胞定位进行预测[10]。二级和三级结构预测：使用SOPMA和Phyre2在线分析软件对蛋白质二级结构、三级结构分析并建模[11]。B细胞表位预测：使用IEDB Analysis Resource在线工具预测B细胞表位[12]。具体网址如表1所示。

表1 在线工具及网址

2 结果与分析

2.1 理化性质

Hc-dhs-28蛋白的氨基酸组成见表2。Hc-dhs-28蛋白由438个氨基酸组成，其中占比最高的氨基酸为丙氨酸 （Ala，10%）。 蛋白分子式为 C2088H3339N569O640S17，相对分子质量为47198.93，理论等电点为8.77，带负电荷残基总数（Asp+Glu）为46个，带正电荷残基总数（Arg+Lys）为51个。预测的半衰期为30h（哺乳动物体内），脂溶指数为86.57，亲水性总平均值为-0.169，脂肪指数为85.53，不稳定性指数为32.32，判定该蛋白为稳定蛋白。

表2 Hc-dhs-28蛋白的氨基酸组成表

2.2 跨膜结构域、亲疏水性和信号肽预测结果

Hc-dhs-28蛋白跨膜区分析结果如图1所示。如果蛋白质包含跨膜区，则它可作为膜受体发挥作用，或是位于膜上的锚定蛋白和离子通道蛋白[13]。由TMHMM软件分析可知，Hc-dhs-28蛋白预测结果均位于膜外，不存在跨膜结构域。

图1 Hc-dhs-28蛋白跨膜区分析结果

Hc-dhs-28蛋白亲疏水性分析结果如图2所示。多肽链的亲疏水性在维持蛋白质三级结构的形成和稳定中具有十分重要的作用。由ProScale软件分析可知，Hc-dhs-28蛋白的平均亲水性系数（GRAVY）为-0.169，该蛋白存在的亲水性氨基酸数量>疏水性氨基酸数量，最大值为2.256，位于第139位（Lys），具有较强的疏水性。亲水性最小值为-2.544，位于第348位（Ile），具有较好的亲水性，分析该蛋白为亲水蛋白。

图2 Hc-dhs-28蛋白亲疏水性分析结果

Hc-dhs-28蛋白信号肽分析结果如图3所示。采用Signa1P软件分析Hc-dhs-28蛋白是否存在信号肽，根据预测结果发现，该蛋白无信号肽存在，表明其为非分泌型蛋白。

图3 Hc-dhs-28蛋白信号肽分析结果

2.3 磷酸化和亚细胞定位预测结果

Hc-dhs-28蛋白磷酸化分析结果如图4所示。蛋白质磷酸化是一种翻译后修饰，磷酸化主要集中在Tyr、Thr和Ser残基上，这些残基具有游离羟基且不带电荷。经过磷酸化后的蛋白质带电荷，使得其结构发生改变，并由此导致蛋白质活性的改变[14]。通过NetPhos3.1在线工具分析得知，Hc-dhs-28氨基酸序列含有43个磷酸化位点，分别为24个丝氨酸、14个苏氨酸和5个酪氨酸位点。采用PSORT Ⅱ在线工具对蛋白质亚细胞定位，结果显示该蛋白可能主要在线粒体上发挥生物学作用。

图4 Hc-dhs-28蛋白磷酸化分析结果

2.4 蛋白质二级结构预测

Hc-dhs-28蛋白二级结构结果如图5所示。使用SOPMA软件预测Hc-dhs-28蛋白的二级结构，α-螺旋占比最高为39.95%，β-转角占比最少为7.31%，无规则卷曲占比34.47%，β-折叠占比18.26%。α-螺旋和β-折叠被认为是蛋白的骨架区域，由于2种结构的特殊性，这2个区域不利于形成位点。根据Hcdhs-28蛋白的二级结构预测结果，虽然α-折叠占比较高，但是结合其亲疏水性，预测Hc-dhs-28蛋白上存在多个抗原位点。

图5 Hc-dhs-28蛋白二级结构结果

2.5 蛋白质三级结构预测

Phyre2是一套可在网络上使用的生物信息学工具，用于预测和分析蛋白质结构、功能和突变[11]。蛋白质结构预测的准确性关键取决于查询序列和模板序列之间的相似性，如果待检测的模板与查询的序列同一性大于30%，那么通常大部分或全部比对将是准确的，并且由此产生的结构元素在模型中的相对位置将是可靠的。低于这个序列同一性水平，Phyre通常会进行自行匹配。如果置信度匹配度高于90%，模型的整体折叠可以肯定是正确的，并且模型的结构元素在模型中的相对位置将是趋于准确的[15]。

Hc-dhs-28蛋白三级结构模型如图6所示。使用Phyre2软件预测Hc-dhs-28蛋白三级结构可知，Hc-dhs-28蛋白模型基于模板c1zbqB_，297个残基（序列的68%）通过单个最高评分模板以100.0% 的置信度建模。Hc-dhs-28蛋白二级结构以α-螺旋为主，其次是β-折叠，与SOPMA预测二级结构结果一致。

图6 Hc-dhs-28蛋白三级结构模型

2.6 B细胞表面抗原表位预测

IEDB在线软件通过6个方面 （线性表位、β-折叠、表面可及性、灵活性、抗原指数和亲水性）的预测确定蛋白的抗原表位。Hc-dhs-28蛋白的预测结果如图7所示，综合二级结构预测结果，去除α-螺旋、β-折叠和疏水区等不易形成表位的区域，分析确定了5个B细胞表位，结果见表3。

图7 Hc-dhs-28蛋白B细胞表位抗原结果

表3 B细胞抗原表位预测结果

3 讨论

开发针对寄生线虫的商业疫苗，一个主要障碍是难以获得能够诱导保护性免疫重组形式的保护性抗原。目前，疫苗接种研究受到从寄生虫提取物中纯化的天然蛋白质含量低、对寄生虫材料的需求量大以及这种方法的成本、安全性和伦理考虑的限制，迫切需要发现特定亚单位疫苗的替代方法[16]。

在世界范围内，家畜寄生线虫依然是严重危害全球畜牧业生产的一类疫病。由于寄生虫病控制目前仍依赖于使用驱虫药，但是寄生虫抗药性问题越来越普遍，意味着这种方法可能已不可持续[17]。虽也有资料报道，氨基乙腈衍生物的出现提供了一种替代方法，但其在使用不到2年的时间里，已有报告称感染羊的线虫对这种新型药物便产生了耐药性[18]。有研究表明，使用天然蛋白提取物接种疫苗后，对家畜线虫感染具有显著的保护作用，证明接种疫苗是可行的[19]。但是目前针对寄生线虫的基因工程疫苗较少，许多研究都还在试验阶段，因此选择合适的抗原来制备疫苗变得尤为关键。捻转血矛线虫的许多抗原被普遍用于防治试验，但随着研究的深入，由于蛋白表达量低、蛋白空间结构折叠出现错误以及不能诱导动物机体产生针对虫体的保护性免疫等原因，需选择合适的抗原进行表达[20]。有研究显示，Hc-dhs-28重组蛋白具有较好的免疫原性，对宿主具有较好的免疫保护效力，是一种潜在的疫苗候选因子，Hc-dhs-28主要在幼虫自由生活期转录，在滞育期达到高峰。在寄生虫自由生活的早期阶段，为进入滞育阶段做好准备而激活滞育形成。这些结果表明，Hc-dhs-28蛋白可能参与滞育的形成[21-22]。

本文分析了Hc-dhs-28蛋白理化特性、结构和抗原表位，显示Hc-dhs-28蛋白不存在跨膜结构域，为亲水性、非分泌型的稳定蛋白，存在磷酸化位点，主要在线粒体发挥其生物学作用。进一步通过生物信息学工具预测结合其二级结构，确定了5个B细胞优势表位。这些结果表明，Hc-dhs-28蛋白有很好的应用价值，具有作为抗原的潜质，表明后期可选择其合适的短肽进行表达，深入分析该蛋白的功能，为捻转血矛线虫的高效安全防控提供理论依据。