畜禽粪便堆肥过程中微生物群落演替

王孝芳 万金鑫 韦中 徐阳春 沈其荣

（南京农业大学资源与环境科学学院/江苏省固体有机废弃物资源化高新技术研究重点实验室/江苏省有机固体废弃物资源化协同创新中心/资源节约型肥料教育部工程研究中心/国家有机类肥料工程技术研究中心，南京 210095）

近年来，随着我国畜禽养殖业的集约化发展，畜禽的养殖数量和规模不断扩大。有研究报道，截至2020年，我国畜禽养殖业每年产生 38 亿t畜禽粪便，但是畜禽粪便的利用率仅有 60%［1］。堆肥能够对畜禽粪便进行无害化、资源化处理，具有产品肥效高、环境污染低及产量高等优点，被认为是畜禽粪便处理的高效途径之一［2-3］。畜禽粪便堆肥是利用广泛存在于自然界的微生物通过一系列的生物化学反应，杀死畜禽粪便中的有害病原微生物及寄生虫卵等，将畜禽粪便中不稳定的有机物质分解转化合成为稳定的腐殖质的过程［4-5］。目前大多数研究还是关注不同处理下特定畜禽粪便堆肥过程中的理化特性及微生物群落的变化［5-7］，但因堆肥物料、堆肥体系、堆肥方法等不同，微生物群落差异较大，尚缺乏对畜禽堆肥微生物群落结构和功能演替的系统总结和认知。本文梳理了畜禽粪便堆肥过程中不同阶段细菌、真菌等微生物群落结构和功能的演替规律；总结了堆肥起始物料的特性（含水量、pH、C/N等）和人为活动（翻堆曝氧、菌剂接种）对堆肥微生物群落演替的影响；比较了当前堆肥微生物群落的研究方法；最后展望了未来畜禽粪便堆肥研究值得重视的科学问题和研究方向。

1 畜禽粪便堆肥微生物群落结构的演替

好氧堆肥的本质是微生物的生化反应，堆肥过程中微生物对有机物的分解、转化、合成起着主导作用。一般根据堆体温度的变化，可将堆肥过程大致为3个阶段：升温阶段、高温阶段、降温腐熟阶段。堆体温度的变化影响了微生物的活性，驱动微生物的演替，同时也受到微生物活动（释放热能）的反馈调节。堆肥微生物主要由细菌、真菌、原生生物、病毒等组成［8］，这些微生物主要来自起始的堆肥物料以及从堆肥的环境中招募获得［9］。随着各阶段有机物质的分解，堆肥体系中各种生化指标不断变化，不同微生物交替占据优势，独立或者协同其它微生物对有机物质进行分解转化，促进堆肥的腐熟［10］。堆肥微生物群落结构的演替与堆肥过程以及堆肥腐熟程度密切相关，因此研究堆肥微生物群落组成及演替有助于理解堆肥过程中物质转化的生物学机制。

1.1 细菌

细菌是堆肥中分布最广、数量最多的生物，占80%-90%［8］。凭借高生物量和大比表面，细菌能够快速利用堆肥物料中易分解的碳氮，如假单胞菌属（Pseudomonas）主要降解脂肪［11］，芽孢杆菌属（Bacillus）主要降解淀粉和蛋白质［12］。细菌利用初始阶段堆体中的可溶性、易降解的化合物，快速增殖，此时细菌的丰度和多样性达到最高。随着堆体温度升高，嗜温细菌的数量不断减少，一些嗜热细菌开始增殖。高温阶段的细菌以芽孢杆菌属为主，如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、环状芽孢杆菌（Bacillus cyclicus）等能耐受65-80℃的高温。这些芽孢杆菌属细菌通过形成内生孢子或厚壁孢子耐受高温、腐蚀、营养物缺乏等不良环境条件［13］。放线菌是一类特殊的细菌，因其对温度和pH强的耐受力，能够通过分泌一些胞外酶分解木质纤维类的复杂化合物，且在高温条件下分解纤维素、角质素等，成为堆肥高温期和降温腐熟期分解木质纤维素的优势种群。其中链霉菌属（Streptomyces）、诺卡氏菌属（Nocardia）、单孢子菌属（Monosporium）和节杆菌属（Arthrobacter）等都是堆肥中常见的放线菌，对堆肥体系中木质纤维素的降解有着重要作用［14］。一般放线菌生长缓慢，但在低（贫）营养水平时，尤其是堆肥的中后期，具有强的竞争优势［15］，丰度快速增加，进一步促进堆肥中难分解有机物的分解利用［16］。不同研究报道的畜禽粪便堆肥中优势细菌存在一定差异，以猪粪堆肥为例，Li等［17］发现接种1%的复合微生物菌剂增加了高温期玉米秸秆猪粪堆肥中黄杆菌属（Flavobacterium）的相对丰度，降低不动杆菌属（Acinetobacter）的相对丰度；Zhou等［18］发现添加生物质炭增加了猪粪堆肥过程中糖单胞菌属（Saccharomonospora）的相对丰度；Wang等［19］也发现木屑猪粪堆肥中细菌群落以芽孢杆菌目（Bacillales）和梭菌目（Clostridiales）为优势菌。虽然都是猪粪堆肥，但不同来源猪粪的物质组成存在一定的差异，同时堆肥初期添加辅料的种类、比例也会影响堆肥中细菌群落的演替。

1.2 真菌

真菌是降解木质纤维素类难降解物质的主要菌群［20-21］，研究表明子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）可以分泌多种纤维素和半纤维素降解酶，例如粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）可以分泌纤维素降解酶和木聚糖降解酶［22-23］，黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）能够分泌纤维二糖水解酶、降解半纤维素的木聚糖酶和纤维素内切酶等酶类［24］。除此之外，真菌还可以凭借菌丝的穿透能力，物理性破坏植物表面的角质层，增加底物与木质纤维素降解酶的接触，加快木质纤维素的降解。与细菌相比，真菌对高温的耐受能力较弱，所以主要是在堆肥的升温和后期的降温腐熟阶段发挥作用。多项研究表明真菌中的子囊菌门、担子菌门是畜禽粪便堆肥过程中普遍存在的优势菌门［25-27］。Mao等［28］研究发现鸡粪堆肥初期念珠菌属（Candida）相对丰度高达69.8%，但高温期降至22.6%，同时隐球酵母属（Cryptococcus）和葡萄孢属（Botrytis）丰度大大增加。其中Botrytis可以产生一种热休克蛋白，在高温条件下保护Botrytis的活性，还可以在去木质化过程中分泌胞外酶［29］。堆肥腐熟期闭小囊菌属（Kernia）成为优势物种，占到80.9%，在富含纤维素的牛、鹿、马、羊的粪便中经常能发现该物种［30］。Wang等［19］发现猪粪堆肥中真菌散囊菌目（Eurotiales）主导初始和腐熟时期，一些属于Eurotiales目的真菌可以降解顽固的物质，如脂肪族化合物、氯酚和多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）［31］。在堆肥体系中，真菌对堆肥物料的分解转化和促进堆肥产品的腐熟稳定具有重要的意义。

1.3 其他微生物

原生动物是一类以细菌或真菌为食的初级消费者，根据其生态功能可分为自养型、共生型、吞噬型和腐生型原生动物［32］，其中腐生型原生动物对堆肥中有机物质的分解具有重要作用［33-34］。另外原生动物倾向于捕食含氮量高的细菌［35］，所以可能影响了堆肥过程中的氮循环。一般原生动物存在于堆肥的水滴中，数量相对较少，其行为与细菌类似［8］。目前堆肥中原生动物相关的研究较少。噬菌体作为一类专性侵染细菌的病毒，也广泛存在于堆肥当中。基于“杀死胜利者”（kill the winner）假说，群落中越是占据优势的宿主菌，越容易被裂解性噬菌体裂解［36］，所以噬菌体势必会影响到堆肥群落中细菌群落的演替。除此之外，噬菌体能够通过裂解细菌促进颗粒有机物向可溶性有机物转化，在微食物环中形成了病毒回路（virus shunt），影响物质的循环［37］。目前堆肥中噬菌体相关的研究仅仅是从堆肥中分离获得如伯克氏菌（Burkholderia）［38-39］、耐万古霉素粪肠球菌（vancomycin-resistant Enterococcus faecalis）［40］等不同病原菌的噬菌体，研究噬菌体的基础特性，并未关注噬菌体对堆肥过程微生物和物质变化的影响。所以未来堆肥相关的研究还可以关注堆肥过程中的原生动物和噬菌体群落的结构及其功能。

不同畜禽粪便堆肥具有特定的微生物组成，其变化也不尽相同。如猪粪堆肥中厚壁菌门（Firmicutes）占 主 导 地 位［41］，而 变 形 菌 门（Proteobacteria）在牛粪中更为丰富［42］。就真菌而言，已发现子囊菌门和担子菌门是鸡粪和牛粪中的核心门［9］。这种变化可能与粪便微生物群落组成的初始差异有关，由动物的饮食和肠道微生物群组成决定［43-44］。一般来说，食肉动物食用蛋白质含量明显高于食草动物的食物［45］。这种饮食差异可能会对粪便微生物群的组成产生影响［46］，与杂食动物相比，食草动物的肠道微生物组已被证明更加多样化［47］。Wan等［48］比较了4种畜禽粪便（食草动物：牛和羊，杂食动物：鸡和猪）堆肥起始和结束时期微生物组成的差异，结果发现细菌和真菌群落根据畜禽食性分为两组：食草动物（绵羊和牛）和杂食动物（猪和鸡）。与猪和鸡粪堆肥相比，羊和牛粪堆肥具有更高的细菌和真菌多样性；羊和牛粪堆肥初期以变形菌门为主，厚壁菌门在猪粪和鸡粪堆肥中占主导地位，且在堆肥过程中相对丰度增加。以真菌为例，在整个堆肥过程中，子囊菌在所有粪便处理中占主导地位；在堆肥后期，牛羊粪堆肥中嗜热链球菌属（Mycothermus）相对丰度较高，而猪、鸡粪堆肥中以热白丝菌（Melanocarpus）为主。所以即使畜禽粪便种类多样，但一定程度上可以根据畜禽粪便的初始特性预测堆肥过程中微生物群落的组成和变化。

2 畜禽粪便堆肥过程中微生物群落功能的 演替

微生物驱动畜禽粪便堆肥的本质是通过复杂的代谢过程实现的。分析堆肥过程中微生物群落结构和功能是建立堆肥特性、群落和代谢之间关系的基础。微生物主要通过分泌胞外水解酶降解由复杂大分子组成的有机物质［49］，而分解产生的水溶性化合物可为微生物生长提供资源，确保了微生物降解过程的连续性。有机物的生物降解转化过程需要脱氢酶、纤维素酶、β-糖苷酶和蛋白酶等多种酶的共同作用。脱氢酶活性因其在呼吸链中的功能而被认为是评价生物活性的一般指标［50］。因此，脱氢酶活性的变化可用于监测堆肥状态并提供有关堆肥成熟度的信息［51］。纤维素酶、β-糖苷酶和蛋白酶分别与纤维素的降解、糖苷的降解和蛋白质中氮的矿化有关［51］。因此，对这些酶活性的监测有助于进一步了解有机物的生物降解过程。有研究发现堆肥过程中纤维素酶活性一般先上升后下降，可能是由于前期分解纤维素的微生物生长缓慢，高温期有机物快速降解；蛋白酶活性在堆肥过程中呈下降趋势，与蛋白类底物逐渐减少有关；脱氢酶被证实与微生物活性有关［52］。一些研究还测定了堆肥中分离获得的单一菌株的产酶降解能力，如热单孢菌（Thermomonospora）在碱性高温条件下产生羧甲基纤维素酶降解纤维素［53］，丝状真菌可以分泌纤维素氧化酶和半纤维素酶降解小麦秸秆［54］，家禽粪便堆肥中分离的耐热细菌马杜拉放线菌属（Actinomadura）能在pH 10.5和70℃时分泌果胶酸裂解酶［55］。

然而，堆肥中物质的分解是不同微生物协同代谢的结果，不能简单地通过几种酶活或分离培养来评估。目前基于宏基因组学分析的PICRUSt和FUNGuild可以分别基于高通量测序数据预测堆肥中细菌和真菌的功能多样性［56-58］。PICRUSt预测细菌功能具有较高的准确性，且被用于医学领域预测药物和疾病对动物/人类细菌代谢的影响［59-60］。FUNGuild数据库包含 9 476条真菌属和种级别的序列，可以根据营养模式将真菌序列分为12个功能组［58］。这两种生物信息学工具为理解堆肥过程中微生物功能演替提供了潜在方法。Ding等［61］比较了不同堆肥系统中细菌代谢功能的差异，结果发现生物反应器堆肥中氨基酸代谢相关基因的相对丰度最高，而传统堆肥中碳代谢相关基因的相对丰度最高。Mao等［28］发现鸡粪堆肥中真菌腐生功能基因的相对丰度随时间逐渐降低，堆肥30 d后，参与柠檬酸循环、糖酵解等碳水化合物代谢的基因丰度增加。Wang等［19］研究发现猪粪堆肥过程中细菌的糖代谢、脂类代谢和多糖合成代谢相关基因的丰度在堆肥前期比较高，而真菌的木材、粪便和植物腐生功能相关基因的丰度在堆肥后期比较高，一定程度说明细菌和真菌交替发挥作用。

3 畜禽粪便堆肥微生物群落演替的影响因子

畜禽粪便堆肥过程中微生物群落的动态演替受到多种因子的调控，因为微生物的生长繁殖与堆肥体系中的环境因子的变化密切相关。影响微生物群落演替的因子可以分为两组：（1）取决于堆肥起始物料的组成，如含水量、pH、C/N等；（2）人为管理过程，如翻堆曝气、菌剂接种等。

3.1 堆肥起始物料特性

粪便中含有大量的营养物质，尤其是禽类，消化道短，摄取的饲料不能被完全吸收，很大一部分营养物质会随粪便排出体外［62］。所以畜禽粪便堆肥初始物料的特性一定程度上受畜禽食性的影响［9］，根据食性一般可以将畜禽分为两大类：食草性和杂食性。一般食草动物以粗饲料、粗纤维为主，而杂食动物的饲料中含有更多的粗蛋白质［43］。所以草食性动物如牛、羊粪便中可能含有更高的碳；而杂食性动物如猪、鸡粪便中可能还有更高的氮［43，63］。Wan等［48］研究发现在羊和牛粪堆肥具有较高的 pH、硝态氮（NO3-N）、总碳（TC）含量和 C/N，而猪粪和鸡粪堆肥具有更高的 EC、铵态氮（NH4-N）、总氮（TN）和总磷（TP）。尽管不同研究中堆肥的起始物料存在差异，但基于畜禽食性可以初步判断粪便堆肥的理化特性和物质降解规律［43］。

含水量：微生物活动需要水作为介质，水中的营养物质维持了微生物的代谢。大量水分蒸发的同时会带走热量，从而对堆肥的温度也起到调节作用。新鲜的畜禽粪便一般含水量较高，容易导致堆体的孔隙减少，氧气含量不足，形成厌氧发酵［64］。研究表明，堆肥起始的最适含水量是50%-60%［65］，随含水量的减少，微生物的分解速率也会降低。故堆肥体系的含水量会直接影响着微生物的生长代谢过程，从而影响着堆肥反应速度和腐熟程度。

pH：微生物对pH的耐受范围较广，5.5-8.0之间都能维持良好的微生物活性［4］。常见堆肥原始物料的pH都在此范围内，畜禽粪便的pH一般呈弱碱性，有利于微生物的生长繁殖。堆体过程中pH是变化的，堆肥初期，微生物降解有机质过程中释放的有机酸可能会使pH降低；随着堆肥的进行，氨挥发会使堆体的pH呈现上升的趋势［66］。

C/N：微生物的生长繁殖需要碳源和氮源，合适的C/N是影响微生物代谢的关键［67］，一般堆肥物料起始C/N会控制在20-35之间。高C/N时，微生物可降解的底物多，堆肥进行缓慢；低C/N时，氮素过剩，易导致氨挥发或从堆肥中浸出而造成氮损失，进而减缓有机物料的降解进程。一般禽畜粪便的C/N较低，以禽畜粪便为主进行堆肥时一般选用高C/N比的农作物秸秆、木屑、锯末、稻草等作辅料来调节堆体的 C/N值［7］。

3.2 人为管理过程

翻堆曝气：畜禽粪便好氧堆肥过程中适当的翻堆曝气可以控制堆肥的温度、去除多余的水分、为微生物提供充足的氧气。如果堆体氧气不足，会抑制好氧微生物的获取，同时厌氧发酵过程中产生的有害物质会进一步抑制微生物，减缓了堆肥的进程，造成堆肥腐熟不彻底。最佳的氧气浓度在15%-20%之间［4］，有利于好氧堆肥的进行。另外，定期翻堆能够影响堆体的温度，一般翻堆后堆体的温度会有所下降，但会在短时间内上升，主要是因为翻堆为微生物活动供应了充足的氧气，微生物继续分解底物产生了热量。堆肥的最佳温度在40-65℃［4］，温度过低不利于物质的降解，温度过高会降低微生物的活性。

菌剂接种：为了加快堆肥中有机物的降解速率，提高堆肥的腐殖化程度，可以通过向堆体添加微生物菌剂来增加微生物的丰度，调节堆肥微生物的菌群结构，促进堆肥的快速腐熟［68］。有研究表明接种有机肥起曝剂，能够加快猪粪堆肥堆体的升温速率，促进堆体提前进入高温期，提高了堆肥的腐熟效率［69］。Jiang等［70］发现10℃低温条件下，接种出芽短梗霉（Aureobasidium paleasum）DW-1后鸡粪秸秆堆肥快速进入高温期且腐熟产品具有更高的种子发芽率。

4 堆肥微生物群落及其功能的研究方法

4.1 传统的微生物研究方法

微生物分离培养和显微计数等传统研究方法是早期分析堆肥微生物的经典方法。首先确定目标微生物，采用选择性培养基筛选获得菌落，进行计数或进一步鉴定菌株的种属信息。López-González 等［71］从堆肥中分离鉴定了4 000多株细菌，属于187个细菌种，这些细菌大多数具有耐热能力且表现出一定的酶促降解能力。但因为堆肥中的微生物是动态变化的，且可培养微生物只占环境微生物总量的0.1%-1%，所以分离培养法评估堆肥微生物时误差大。显微计数是利用显微镜观测样本中的细胞数量，虽然结合核酸染色可以区分死活细胞［72］，但工作量大，操作繁琐，耗时耗力。

4.2 分子生物学研究方法

与传统的微生物研究方法相比，现代分子生物学方法具有灵敏度高、数据量大等优点，为原位揭示堆肥微生物群落的组成和功能开辟了新途径。堆肥体系中微生物群落结构复杂，微生物数量巨大，分子生物学方法能在追踪微生物数量变化的同时，对物种分类、自然进化进行全面客观的分析。目前堆肥微生物的分子生物学研究方法主要包括变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、磷脂脂肪酸谱图分析（phospholipids fatty acids，PLFAs）、荧光定量 PCR、高通量测序技术等。Cherif等［73］利 用DGGE和ARISA（automated ribosomal intergenic spacer analysis）指纹图谱方法研究了不同城市固体废弃物堆肥改良土壤中细菌群落的结构和多样性。Tkachuk等［74］利用靶向 16S rRNA 高通量测序描述了病死畜禽堆肥的微生物群落。这些分子生物学方法在数据量的大小、测序精度和深度上有各自的优缺点，需要根据特定的堆肥体系和研究目标进行选择。

4.3 整合多组学研究方法

由于堆肥体系中微生物群落结构和功能的复杂性，任何单一方法都无法全面阐明堆肥体系中的微生物群落组成和功能的演替规律，因此随着整合多种高通量方法的多组学技术逐渐兴起，通过宏基因组、宏转录组、宏蛋白组、宏代谢组等多组学技术可以挖掘畜禽粪便堆肥中微生物物种组成、基因功能、代谢通路、关键物质等信息。Antunes等［75］利用宏基因组和宏转录组分析了高温堆肥中的微生物群落结构和动态。多组学研究有助于构建堆肥微生物群落结构、功能及物质转化的关系，更加全面了解微生物群落和功能演替的生物学机制［76］。

5 结论与展望

好氧堆肥被认为是处理畜禽粪便友好且高效的可持续技术，主要是通过堆肥微生物的生化活动来驱动，因此是一个动态微生物学过程。在堆肥过程中，微生物群落不断的交替演变，而堆肥原料的不同，这些堆肥微生物的结构组成和群落多样性也会随之发生改变。不同微生物群落之间除了相互竞争环境生态位也会根据各自的功能不同来协同进行堆肥物料的降解转化。目前针对堆肥微生物的研究主要集中于堆肥体系中可培养微生物的分离培养和特定的功能微生物的研究等方面，对于堆肥过程中群落结构的组成和功能及其在堆肥过程中的动态演替还未进行全面系统地阐述。因此探究堆肥过程中微生物的生态学机制有利于深刻理解整个堆肥过程。堆肥物料降解过程中微生物群落间存在多种相互作用的生态关系，明确这些关系有利于全面理解堆肥微生物的生态学机制。通过对堆肥微生物群落和功能的研究，能够进一步了解堆肥过程中物质的降解及转化的规律，深入理解堆肥过程中的能量转化和物质代谢。对于改进以及开发新的堆肥技术提供一定的理论支持。不仅在理论上能够更深入地认知堆肥体系中微生物群落的生态学过程，而且在实际应用中可以科学指导堆肥工艺的改进与实现堆肥工艺的现代化。

在传统堆肥的基础上进一步提升改善堆肥工艺，提高堆肥的效益，减少对环境的污染，如气流膜堆肥，允许水蒸气挥发，但阻止雨水进入和臭气的溢出，减少了氮素损失，提高堆肥的肥效。

基于畜禽粪便堆肥微生物群落的演替，挖掘不同阶段驱动堆肥的关键微生物，筛选获得关键微生物，发酵后以微生物菌剂的形式再次接种到堆体中，有效促进堆肥的效率，缩短堆肥的时间。

未来研究在关注堆肥微生物组成、分布及动态变化的基础上，还需要关注畜禽粪便堆肥过程中病原菌、抗生素抗性基因的消减情况，确保堆肥腐熟产品的无害化。

除了对畜禽粪便堆肥过程中微生物群落结构和功能演替的监测，还需要监测堆肥产品堆放、存储及施用过程中微生物变化及对土壤环境和作物的影响。