堆肥腐殖化过程及微生物驱动机制

王宇蕴 赵兵 马丽婷 李兰 邓亚琴 徐智

（云南农业大学资源与环境学院，昆明 650201）

目前，随着中国人口的快速增长和经济水平的提高，农业废弃物以每年5%-10%的速度上升［1］，年产量高达50亿t［2］。其中秸秆年产量约9亿t，未利用的约3亿t［3］；畜禽粪污产量为38亿t，其综合利用率却不到60%［4］；蔬菜废弃物（尾菜）达到约5 亿t，未利用比例超过90%。由于农业废弃物产量巨大，处理工艺一直是研究的重点，填埋和焚烧作为传统处理工艺，在导致营养物质流失的同时，对环境及人体健康产生了严重的负面影响。堆肥由于其工艺相对简单，投资及运行费用相对较低，逐渐发展完善成为农业废弃物处理的主要技术手 段［5-6］，微生物（细菌、真菌、放线菌）是其发酵的核心，能够将农业废弃物转化成为腐殖质（HS）等高附加值产品［7-10］。

利用好氧堆肥，微生物可以将有机物料分解为CO2、热量、生物质及HS等［11-13］。农业废弃物因来源、气候条件及产地等不同而性质各异［14］，尤其秸秆类废弃物因其高有机质特性成为了堆肥理想物料［15］。虽然高半纤维素、纤维素和木质素形成不易被微生物降解的复杂结构［16］，但木质纤维素的分解有利于堆肥过程的HS形成［17-18］。HS作为堆肥最重要的产物，在改良土壤的同时，也是评价好氧堆肥过程最重要的指标之一［19］，其中堆肥腐殖化过程是HS大量聚合的关键时期［20］，主要发生在堆肥的降温阶段，真菌在此过程中起主导作用的同时，也可能是堆肥腐殖化过程木质素分解和HS聚合的主要驱动因子［21-23］。因此，研究堆肥腐殖化过程及微生物驱动机制对农业废弃物资源化处理具有重要的理论及现实意义。

目前，大量研究者将木质素类废弃物利用好氧堆肥工艺进行了堆肥化处理，研究堆肥过程中微生物群落结构演替、关键酶活、前体物质浓度变化等，并进一步分析堆肥腐殖化进程及微生物驱动机制，提出今后堆肥腐殖化过程研究的重要方向，以期为促进堆肥腐殖化过程，强化农业废弃物资源化利用提供科学参考。

1 堆肥腐殖化过程

堆肥腐殖化过程涉及一个复杂的微生物主导的生物和生化过程，其中腐殖酸的形成过程被称之为腐殖化。简单来说，堆肥腐殖化是由一系列不同微生物同时作用以降解有机物产生腐殖酸为目的，其中酶催化是堆肥过程中的驱动因素［24］。在好氧堆肥过程中，升温和高温阶段中嗜热微生物占主导地位，首先将纤维素和半纤维素分解形成碳水化合物，在降温期和腐熟阶段，随着纤维素和半纤维素含量的减少，木质素开始被嗜温性微生物（真菌）通过分泌木质素酶的形式分解形成酚和醌等物质，然后形成HA［25-28］，因此木质素被称之为HS形成的原料和骨架。此外，由于HS通常由难以彼此分离的不同分子组成，因此很难完全阐明其结构，根据pH溶解度，HS可细分为富里酸（FA）、腐殖酸（HA）和胡敏素（HM）。根据含氧官能团的大小顺序为FA、HA和HS，而聚合物结构的大小顺序则相 反［29-30］。分子量较高的HA具有更多的芳香碳，分子量较低的FA则具有更多的脂肪族碳和羧基［31-32］，堆肥腐殖化过程是一个FA含量降低，HA含量升高的过程，在此过程中木质纤维素的降解有助于HA的形成［27，33］，其中降解酶扮演着重要的角色。

1.1 木质素的降解

木质素作为一种可再生的天然芳香族高分子聚合物，主要由苯丙烷醇及其衍生物通过醚键和碳键连接而形成聚酚类三维网状高分子化合物，因其复杂的结构难以被微生物降解［34］。真菌作为降解木质素最有力的微生物，因对温度特殊的喜好，在好氧堆肥过程中大量存在于冷却及腐熟期，此外由于木质素在升温期和高温阶段不能完全被分解，因此降温阶段木质素的降解对腐殖化进程显得尤为重要。

真菌对木质素的降解主要通过其分泌的木质素酶来起作用，包括木质素过氧化物酶（LiP）、锰过氧化物酶（MnP）、漆酶（Lac）等。LiP能够催化堆肥过程中各种芳香族有机化合物酚（愈疮木酚、香草酸醇、儿茶酚、丁香酸）和非酚性木质素的分解［35］，形成苯氧自由基等，这些自由基通过与酚类化合物聚合、侧链裂解、去甲基化、C-C裂解和芳香环开环的偶联反应，催化木质素中的非酚类芳香底物和β-o-4醚键和Cα-Cβ键的裂解［36］，LiP主要由担子菌和子囊菌门等真菌（白腐菌、褐腐菌）分泌［37］。MnP和LiP不仅表现出协同效应，因具有较高的氧化还原电位，对木质素具有独特降解作用。MnP由Mn2+和血红素基构成活性中心，Mn2+的作用是传递电子，H2O2作为电子受体，接受Mn2+的一个电子，Mn3+与草酸盐和乙酸盐等小分子鳌合，从而促进木质素被氧化，然后去甲基化，烷基苯基键断裂，Cα-Cβ键断裂最终实现木质素降解［35，37-38］。MnP大多来自担子菌门中的P. chrysosporium、P. radiata 和 Rigidoporus lignosus，此外，在白腐菌中MnP的表达比LiP更普遍［39］。Lac作为一种含铜的多酚氧化酶，是一种糖基化蛋白质，可以通过氧化各种底物，包括酚类、芳胺类、苯胺类、硫醇类和木质素，将分子氧的电子还原成两个水分子。此外，Lac的氧化反应也会导致自由基的形成，自由基作为酶的中间底物，能够与具有高氧化还原电位的各种底物相互作用，从而增强解聚反应，初始自由基通常是不稳定的，并在酚类化合物氧化系统中从酚转化为醌，对HS的形成起重要作用［35］。主要存在于Trametes versicolor、P. placenta、H. jecorin和Xylaria sp.等 真菌中。真菌能氧化酚类化合物，生成苯氧自由基和醌类化合物，与软腐菌相比，白腐菌和褐腐菌的木质素降解率较高［40］。在好氧堆肥腐殖化过程中，木质素降解以后以酚、醛等前体形式与蛋白质进行缩合形成腐殖质。

1.2 HS前体物质的形成

在好氧堆肥腐殖化过程中，来源广泛的有机成分被微生物降解为小分子产物，小分子产物可通过微生物细胞内代谢生成中间体作为HS形成重要的前体物质，这些前体物质通过特定途径聚合形成HS［41］，此外关于腐殖化过程中HS形成的美拉德反应、木质素-蛋白质理论和多酚-蛋白缩合理论等都一定程度上强调了前体相互作用对HS形成的重要性［42］，因此在腐殖化过程中前体物质对HS的形成具有重要的作用。

在好氧堆肥过程中，HS前体的形成来源于微生物对木质纤维素的分解，前体物质的产生主要发生在升温和高温阶段，而HS的聚合则主要发生在降温和腐熟阶段［25］。前体的形成可分为分解和合成两个部分，大部分有机物首先被微生物分解，然后通过低分子量化合物（如多酚、羧基和氨基酸等）的生化途径形成HS前体，随后前体物质形成 HS［26-28］。研究发现，由不同类型多糖组成的纤维素和半纤维素能够被微生物分解为单糖等，而作为聚酚类三维网状高分子化合物的木质素则能够被微生物转化为更小的芳香物质，这些较小的分子物质一部分可以被微生物用作营养物质，另一部分形成醌类、芳香醛类、醇类、开环产物、多酚或酚类衍生物（羟基醌与氨基酸）等前体物质，进一步形成 HS［41，43-44］。主要作用机理是木质素分解产生的多酚或酚类衍生物与氨基酸等蛋白质发生反应，一部分首先形成腐殖酸分子核心，另一部分通过聚合形成FA，FA再进一步缩合形成HA，最后形成HS，进一步说明木质素及其降解产物对腐殖化进程的重要作用［45］。

1.3 堆肥腐殖质形成的主要影响因素

在堆肥腐殖化过程中，木质素的降解与微生物的代谢和降解酶离不开关系，然而由于微生物在不同的代谢环境中，具有不同的适应性，适宜的环境能够激发真菌丰度，提高关键酶活性来深化木质素降解，强化堆肥腐殖化进程，其中温度、pH等环境因素是影响腐殖化进程的关键环境因子［41，46-50］。

HS作为堆肥的主要产物，其芳香部分被认为来自木质素，而木质素难以降解的特性使得其在高温期不能完全被分解，真菌对木质素的降解效果远远高于细菌和放线菌，并且高温期的温度不能满足真菌菌群的有效生长，此外，木质素降解酶最佳活性和对木质素最大降解速率所适宜的温度均不能超过45℃，说明温度对腐殖化进程的重要性。堆肥是一个趋碱的过程［51］，且大部分降解酶所适宜的pH为中性偏酸［38，40］，此外堆肥pH值的高低也会影响微生物的活性以及代谢，一些真菌不能抵抗极端环境条件（高温和pH）。研究发现，调节堆肥初始pH值对堆肥过程中微生物群落结构有显著影响［52］，在堆肥过程中所涉及的微生物都是在特定的pH范围内代谢并繁殖，其中细菌适宜pH 在6-7.5，大多数真菌喜欢酸性条件，并且一些真菌生长环境pH值不宜超过7.5［11］，因此调节或控制腐殖化阶段适宜的pH来提高微生物丰度及降解酶的活性，从而促进堆肥腐殖化进程可能是提高堆肥腐质化进程的重要途径之一［52］。

2 堆肥腐殖化微生物（真菌）驱动机制

真菌对于木质素的降解能力显著高于细菌和放线菌，由于高温阶段特殊的温度环境抑制了真菌的繁殖与代谢，恰恰降温阶段的环境为真菌繁殖代谢提供了温床，这就有助于进一步深化木质素分解，产生更多的前体物质（氨基酸、糖类、酚类、羧酸等）以合成HA，结合HA在降温及腐熟阶段大量生成，因此，推测真菌群落的演替可能是HA合成的一个主要驱动因素。微生物驱动腐殖质的形成与酶密切相关，虽然Lac能够催化酚类化合物的单电子氧化成自由基中间体，这些中间体随后可以通过共价键相互偶联，加速腐殖化过程，从而参与HA的形成［53］。此外，也有研究通过在固体废弃物堆肥中接种漆酶发现，腐殖化速率得到显著提高［54］，但合成HA的具体机理机制有待进一步研究。

研究发现高木质纤维素废弃物堆肥腐殖化过程中真菌以子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）为主［24，55-56］，其中子囊菌门中的木霉属、曲霉属和裸节菌属，担子菌门中的鬼伞属和平革菌属等真菌是堆肥腐殖化过程中的主要菌属［24，57-59］。担子菌门中的白腐真菌对木质素的降解具有特殊的能力，接种白腐真菌可以促进木质纤维素的生物降解和HA的形成，从而促进腐殖化过程［60］。P. chrysosporium作为担子菌门的一种，对木质素具有极强的降解作用，在降温阶段接种是保证P. chrysosporium活性的有效方法，其中在堆肥降温期接种P. chrysosporium是促进纤维素和木质素降解，促进堆肥腐殖化的重要手段［21，52，61-62］。Tortosa等［63］通过对橄榄废弃物堆肥研究发现，真菌多样性的增加以子囊菌们（Ascomycota）为主，此外堆肥过程中真菌丰度的增加，也进一步证实了真菌在腐熟阶段的重要作用，其中部分担子菌在腐殖化过程中呈上升趋势，并且与腐殖化参数呈显著正相关。

提高腐殖化过程中真菌群落的丰度，特别是增加子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）是促进腐殖化进程的有效方法。在前体物质转化为HS的过程中，提高关键真菌的丰度，深化木质素的降解以提高前体物质对促进堆肥腐质化过程至关重要，这也是目前研究清楚的堆肥腐殖化微生物（真菌）驱动机制。

3 结论与展望

本文综述了堆肥腐殖化过程中木质素酶降解机制及真菌的驱动作用，在好氧堆肥中掌握腐殖化进程中的微生物群落演替，是深化堆肥腐殖化进程中木质素降解，强化HS形成的关键步骤。木质纤维素类生物质好氧堆肥过程中，在腐殖化阶段以子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）为主的真菌，包括木霉属、曲霉属、裸节菌属，鬼伞属和平革菌属等通过大量分泌木质纤维素关键降解酶（LiP、MnP和Lac等）进一步深化木质素的持续降解，以提高HS前体物质的补充是强化堆肥腐殖化进程的主要作用机理。但目前对堆肥腐殖化过程的腐殖质合成途径和关键驱动因子研究较少，探索堆肥过程中参与HS合成代谢途径的关键基因和酶，鉴定功能微生物特性以提高微生物产酶能力，并确定微生物在堆肥过程中的具体功能和作用，以强化腐殖化进程并提高堆肥产物HS含量，是今后堆肥腐殖化过程研究的重要方向。