虾青素对豹纹鳃棘鲈体色、肌肉组织结构和肠道微生物的影响

■陈 燕 王湘君 陈 文 匡浩宇 周 琪 王伟康 陈 冰

（1.海南热带海洋学院，海南三亚 572022；2.海南省热带海洋渔业资源保护与利用重点实验室，海南三亚 572022；3.广东省农业科学院动物科学研究所，广东广州 510640）

鱼类是优质食物蛋白源，能为人体各阶段生长发育提供所需的营养物质。基于水产养殖的快速发展和鱼粉供应的日益短缺，用价廉、质量高的动植物蛋白源替代水产饲料中昂贵的鱼粉是保护海洋渔业资源和确保海洋生物可持续发展的重要途径。黑水虻（Hermetia illucens, Black sodier fly meal, BSFL）是一种以腐食性生物（如畜禽的粪便、生活垃圾等）为食的，能将废物转化为富含氨基酸和脂肪酸的优质昆虫蛋白，具有繁殖周期短、生长迅速、世代间隔短、饲养简单的优点，国内外新型流行的饲料用蛋白源[1]。与鱼粉相比，黑水虻含有与鱼粉必需氨基酸模式相似的多种必需氨基酸，且其中的蛋氨酸、亮氨酸和赖氨酸的含量较高，还富含不饱和脂肪酸和必需脂肪酸，特别适合于替代水产饲料中的鱼粉[2-3]（见表1、表2）。

表1 黑水虻幼虫和鱼粉之间必需氨基酸的比较(mg/g)[2-3]

表2 黑水虻幼虫中不饱和脂肪酸的含量(%)[2-3]

鱼类肠道微生物被认为对宿主的生命活动起重要的作用，其中的有益菌属可通过改善宿主的免疫、营养吸收和内环境等来促进宿主生长发育[4-8]。鱼类肠道菌群结构受水体环境[4]、摄食类型[5]、发育阶段[6]、营养生物节律[7]等因素的影响。宏基因组学（Metagenomics）即微生物环境基因组学，研究手段有全宏基因组技术和16S rRNA 片段扩增技术。物种间16S rRNA 序列既有高变区（V 区，物种之间有差异）也有保守区（物种之间高度相似），其中的V4～V5区特异性好，数据库信息全，是细菌多样性分析注释的最佳选择。因此，16S rRNA 也被称为细菌系统分类研究中最常用的和最有用的分子钟。前期试验已经采用不同比例的黑水虻替代鱼粉研究对石斑鱼的影响，筛选出黑水虻和鱼粉的最佳比例，建立了针对养殖石斑鱼的饲料配方。豹纹鳃棘鲈（Plectropomus leopardus），隶属于石斑鱼亚科，其肉质细腻、营养全面，且体色艳丽，是一种具有较高的营养、经济和观赏价值的海水鱼类。日常生活中，豹纹鳃棘鲈体色与其经济价值和观赏价值密切相关，故对该种鱼的体色进行研究很有实际意义。迄今，关于鱼类体色的研究已有一些报道[9-10]，但涉及豹纹鳃棘鲈的研究不多。

虾青素是一种3, 3-二羟基-4, 4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素，呈亮红色橙色，由一些植物、微藻和微生物合成[11]。天然虾青素主要来源于雨生红球藻[12]。虾青素因其抗氧化力和多种生物功能(如皮肤或皮肤色素沉着、增强免疫力、缓解压力以及对生长性能和生存的积极影响)，作为饲料添加剂广泛应用于水产养殖业[9-10，13-15]。关于在昆虫蛋白和鱼粉最佳配比基础下添加虾青素对豹纹鳃棘鲈肤体色、肌肉组织形态和肠道菌群的影响尚未见报道。

本试验以豹纹鳃棘鲈为研究对象，探究在最佳的昆虫蛋白源和鱼粉配比的基础饲料中添加不同水平虾青素对其体色、肌肉组织结构和肠道微生物的影响，进而为豹纹鳃棘鲈养殖产业的健康发展提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 饲料配方和养殖试验

按照豹纹鳃棘鲈的营养需求，其配合饲料中的蛋白质源由鱼粉（FM）和黑水虻幼虫粉提供，脂肪源为鱼油和大豆油，小麦粉为碳水化合物源，按前期研究结果设计基础饲料配方（见表3），分别向基础饲料中添加0、0.025%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%的虾青素配制了6 种等氮等能的饲料，标记为D 0、D 0.025%、D 0.05%、D 0.10%、D 0.15%、D 0.20%组。试验所用虾青素由德国巴斯夫（BASF）中国有限公司提供，虾青素主要提取于雨生红球藻，浓度为10%。

表3 试验饲料组成及主要营养水平（干物质组成）

豹纹鳃棘鲈饲养试验在海南陵水德林诚信水产有限公司基地室内循环水养殖系统中开展。商业饲料每天喂食2 次，暂养2 周。正式试验开始后，禁食24 h，然后540 条鱼将随机分布在室内海水循环系统（500 L/箱、30 尾/箱），3 个重复组。每日投喂2 次（上午08：00；下午16：00），并记录日摄食量和死亡数。每周进行1次海水交换（30%的系统容量）。在整个试验过程中，使用便携式多探头水表监测水质，其中溶氧保持7.0 mg/L以上，水温28.0～29.0 ℃。

1.2 样品收集和指标测定

养殖周期结束后，每个养殖箱随机抓取10 尾豹纹鳃棘鲈，用MS-222 对取样的鱼进行麻醉。使用滤纸吸干豹纹鳃棘鲈体表水分，然后选用CR-400 色彩色差计测量鱼类体色，分别检测豹纹鳃棘鲈的背部和腹部的亮度（L*）、红色（a*）和黄色（b*）。

测定鱼类体色后，冰上解剖，摘取豹纹鳃棘鲈背部、腹部皮肤和肌肉测定总类胡萝卜素含量。总类胡萝卜素测定方法按照陈秀梅[16]所述的方法。

类胡萝卜素含量（F，mg/kg）=[（吸光值×常数（104）×提取液体积（mL）]/[（吸光系数（2 500）×样品湿重（g）]

1.3 组织切片制作及观察

按以上同样的方法，摘取养殖鱼背部肌肉，并切成1 cm×1 cm左右的块状并用4%多聚甲醛固定。采用苏木精-伊红（H.E.）染色法进行染色[按照病理实验检测SOP 程序进行修剪、脱水、包埋、切片、染色、封片）并于全景切片扫描仪[3DHISTECH（Hungary），PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000]和正置白光拍照显微镜（Nikon，Japan，Eclipse Ci-L）进行图片采集。

1.4 16S rRNA基因测序

按以上同样的方法将鱼麻醉并于冰上解剖，每个养殖缸随机抓取5尾鱼于无菌条件下将致死的豹纹鳃棘鲈肠道内的样品挤出，肠道样品-80 ℃冷冻备用。使用DNA提取试剂盒从样本中提取DNA，使用Power Soil DNA Isolation Kit（MoBio）检测DNA 浓度。采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC”序列的下游引物扩增V3 和V4 区。通过高通量测序对16S rRNA基因V4～V5区进行分析并对肠道细菌群落进行表征。基于数据均一化后的OTU物种丰度谱，再对OTU 进行丰度、多样性指数等分析，同时对物种注释，在各个分类水平上进行群落结构的统计分析（见图1）。

图1 16S rRNA基因测序流程

2 结果与分析

2.1 虾青素对豹纹鳃棘鲈皮肤色度值的影响（见表4）

从表4中可见，虾青素使豹纹鳃棘鲈的背部和腹部体色L*值变小（腹部D 0.10%组除外），但背部D 0.15%组L*值与对照组差异不显著（P＞0.05），而腹部D 0.10%组L*值显著高于对照组（P＜0.05），说明D 0组（对照组）的鱼背部和腹部体色除背部D 0.15%组和腹部D 0.10%组除外较其他各组的要明亮。虾青素能使豹纹鳃棘鲈的体色a*值变大，即D 0.20%组的豹纹鳃棘鲈体表红色比D 0组（对照组）的更明显，尤其对D 0.10%组和D 0.15%组的腹部影响更大。虾青素能使豹纹鳃棘鲈的体色b*值变大，即饲料中添加不同水平虾青素比D 0组（对照组）能使豹纹鳃棘鲈的体色呈现黄色，尤其对D 0.10%组和D 0.15%组的腹部影响最大。总体而言，D 0.10%组和D 0.15%组虾青素对豹纹鳃棘鲈体色a*值和b*值影响最为明显。

表4 虾青素对豹纹鳃棘鲈皮肤色度值的影响

2.2 虾青素对豹纹鳃棘鲈背部、腹部和肌肉总类胡萝卜素含量的影响（见表5）

表5 虾青素对豹纹鳃棘鲈背部、腹部皮肤和肌肉总类胡萝卜素含量的影响（mg/kg）

从表5可以看出，随着饲料中不同水平虾青素的添加，背部、腹部和肌肉总类胡萝卜素含量均与对照组存在显著性差异（P＜0.05），其中D 0.10%组和D 0.15%组的豹纹鳃棘鲈背部、腹部和肌肉总类胡萝卜素含量均显著高于对照组（P＜0.05）。

2.3 虾青素对豹纹鳃棘鲈肌肉组织结构的影响（见图2）

由图2可知，a～f和A～F分别对应是D 0、D 0.025%、D 0.05%、D 0.10%、D 0.15%组和D 0.20%组豹纹鳃棘鲈肌肉组织结构在40×和400×放大倍率下的观察。饲料中添加不同水平的虾青素对豹纹鳃棘鲈肌肉组织结构无显著性影响。各组组织切片显示肌肉切面可见肌细胞边界清晰、排列整齐、走形一致，高倍下的肌细胞横纹清晰，未出现变性和坏死；未看见结缔组织的增生与炎性细胞的浸润。

图2 虾青素对豹纹鳃棘鲈肌肉组织结构的影响

2.4 虾青素对豹纹鳃棘鲈肠道菌群的影响

2.4.1 下机数据处理（见表6）

采用Illumina MiSeq/HiSeq 测序平台得到的下机数据（Raw Data）经过数据拆分、去引物序列、PE Reads 拼接、Tags 质量及长度过滤和截取以及去嵌合体后获得最终的有效数据（Effective Tags），具体的数据产出统计结果见表6。基于OTU的绝对丰度及注释信息，将各组数据进行不同分类水平[界（Kingdom），门Phylum，纲（Class），目（Order），科（Family），属（Genus），种（Species）]展示，可精确到“属”水平。

表6 数据预处理统计及质控

2.4.2 肠道微生物的变化

图3为豹纹鳃棘鲈肠道提取物测序统计各分类水平的物种在每个样本中的相对丰度，图3a，图3b，图3c、图3d、图3e分别为各分类水平肠道菌群的直方图。门级水平上前6种优势菌群（相对丰度＞1%）为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、螺旋菌门（Spirochaetes）、OD1菌门，其中前4种为主要的菌群。各组鱼肠道菌群（前4种）分别占比：D 0组：55%、15%、6%、6%；D 0.025%组：39%、24%、7%、26%；D 0.05%组：31%、24%、15%、11%；D 0.10%组：37%、32%、8%、8%；D 0.15%组：38%、30%、11%、9%；D 0.20%组：29%、39%、15%、9%（见表7）。属级水平的属科有15种，其中属于变形菌门的有5种，分别是寡养单细胞属（Stenotrophomonas）、青枯菌属（Ralstonia）、短波单胞菌属（Brevundimonas）、不动杆菌属（Acinetobater）、假单胞菌属（Pseudomnas）；属于厚壁菌门的有6种，分别是乳酸杆菌属（Lactobacillus）、片球菌属（Pediococcus）、颤螺旋菌属（Oscillospira）、嗜胨菌属（Pepeoniphilus）、Allobaculum菌属、瘤胃球菌属（Ruminococcus）；属于拟杆菌门的有普氏菌属（Prevotella）、Sediminibacterium菌属、类杆菌属（Bacteroides）；放线菌门的有棒状杆菌属（Corynetobacterium）。其他菌群如放线菌门（Actinobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）、蓝菌门（Cyanobacteria）等，这些菌群组成复杂繁多故不一一例举。

表7 豹纹鳃棘鲈肠道微生物门级对比(%)

图3 豹纹鳃棘鲈肠道提取物测序物种的相对丰度

3 讨论

在本试验条件下，添加虾青素D 0.10%组和D 0.15%组豹纹鳃棘鲈背部和腹部的红色值和黄色值最大，显著高于D 0 组，促使其背部和腹部变红；此外，D 0.15%、D 0.20%组豹纹鳃棘鲈背部、腹部和肌肉中类胡萝卜素含量也最高，显著高于对照组。研究表明，在黄颡鱼[16]、大鳞副泥鳅[17]、金曼龙鱼（Trichogaster microlepis）[16]、东星斑[18]、锦鲤（Cyprinus carpioL.）[19]和血鹦鹉[20]饲料中添加100～200 mg/kg 的虾青素显著改善了体色。在金曼龙鱼中研究发现，色素主要沉积在鱼皮、鱼鳞和鱼鳍表面[16]。目前，国内关于虾青素在不同鱼类的研究中，会因虾青素的来源和虾青素的计量单位不同（饲料中），其结果会有差异。但就有效成分而言，试验设计的青虾素含量基本在0～300 mg/kg 范围（有效成分）或0～0.3%（占饲料的百分比）。本试验中所用的虾青素来源于雨生红球藻源（10%），且为饲料中的含量，按有效成分计算本研究结果与以上试验结果一致（100～150 mg/kg）。

鱼类的背部和腹部肌肉部分是给人体提供优质蛋白源的主要可食部分，其中的着色是大多数消费者所青睐之处，比如人们偏爱虾青素含量高的粉红色的三文鱼肉。大多数水产动物及动物组织的颜色归因于各种类胡萝卜素的存在[21]。在大西洋鲑鱼饲料中添加88.6 mg/kg 虾青素增加了鲑鱼肌肉中的色素沉着[22]。在虹鳟鱼饲料中添加虾青素含量从0 增加到27.6 mg/kg，导致肌肉中总类胡萝卜素含量和肌肉色度值增加。随着虾青素含量从27.6 mg/kg 增加到46.1 mg/kg，总类胡萝卜素含量和色度值没有明显增加[23]。体色是鱼类的重要遗传性状之一，除了受外界因素（如外源性添加剂）的影响外，还受到生理状态以及体色基因（如SOX10和MITF基因）的调控的影响。在对大鳞副泥鳅的研究结果表明，SOX10和MITF在大鳞副泥鳅皮肤和肌肉中均表达，且饲料中添加150 mg/kg虾青素对各组大鳞副泥鳅皮肤和肌肉组织中SOX10和MITE基因表达量均有显著性影响[24]。本研究中未涉及相关调控基因的测定，是否也存在以上类似的现象，有待进一步研究分析。综上所述，100～200 mg/kg虾青素添加于鱼类饲料中有助于体色中红色色泽的改善。然而，当饲料中添加超过一定水平的虾青素，体色色度值将没有明显增加，主要的原因可能是过量的虾青素不能被鱼类所充分吸收，故不能被沉淀[23]。

肠道中的微生物菌落和代谢产物直接宿主的营养、能量的吸收和代谢、肠道免疫功能等。在本试验中，Illumina MiSeq/Hiseq 测序平台用于研究豹纹鳃棘鲈肠道菌群组成，不同虾青素对豹纹鳃棘鲈肠道菌群丰度影响较高的4 种菌门分别是变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门，这与对斑点叉尾鮰、银鲫和异育银鲫肠道优势菌群的研究结论一致[25]。变形菌门是细菌中最大的菌门，大部分病原菌（如霍乱弧菌、大肠杆菌、幽门螺杆菌、沙门氏菌等）都属于变形菌门。研究显示，导致生物功能障碍和疾病风险增加的有可能是变形菌门。放线菌门是水生和陆地生态系统中普遍存在的最大细菌门之一，具有较高的G+C含量[26]，并且一直是新型抗生素的极佳来源，属于潜在益生菌。厚壁菌门中的某些细菌在促进肠道中纤维素分解和多糖发酵中起重要作用[27]，通过这样的方式可以提高机体的免疫力[28]。拟杆菌属被认为是宿主肠道中重要的微生物，可降解碳水化合物，例如多糖和蛋白质[29]。本试验发现随着饲料中添加的虾青素的增加，变形菌门丰度在降低，说明饲料中添加适量的虾青素有助于提高鱼体的抗病力；而厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门这3种菌门丰度随着饲料中的虾青素水平的增加而增加，其中厚壁菌门、拟杆菌门在D 0.20%组时丰度达到最大，放线菌门随饲料中虾青素水平的增加，D 0.025%～D 0.20%组的放线菌门丰度均高于对照组，且在D 0.025%组时丰度达到最大。因此可见，豹纹鳃棘鲈鱼养殖过程中在其饲料中添加虾青素会改变其肠道菌群，在虾青素添加量为0.20%时影响最大。

研究表明，在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）养殖中用适量黑水虻幼虫喂养，改变了虹鳟的肠道菌群和食糜有关的菌群，提升了虹鳟肠道有益菌群的增加，改变有益菌群的多样性[30-31]。综上所述，应用黑水虻替代养殖过程的鱼粉对水产动物的机体健康和生长并无不良影响，甚至适量地使用黑水虻代替鱼粉有利于提升水产动物的生长性能，主要原因可能是黑水虻中的几丁质和甲壳素可提升水产动物肠道有益菌群的多样性。本试验所用基础饲料是含有10%的黑水虻幼虫粉的配合饲料，在此基础上添加虾青素，饲料中随着虾青素的添加，特别是0.20%的添加有助于改变该种鱼的肠道微生物的多样性，是否与黑水虻幼虫粉有关，有待进一步试验考证。

4 结论

在黑水虻幼虫粉和鱼粉最优配伍饲料配方基础上，添加0.10%～0.15%（即100～150 mg/kg）虾青素有助于使豹纹鳃棘鲈背部和腹部变红和变黄，且对肌肉组织无影响，同时有利于提高肠道厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门等有益菌属的多样性和丰度，有利于提高豹纹鳃棘鲈机体的免疫力。由此说明在黑水虻幼虫粉和鱼粉最佳配伍基础配方中添加虾青素（雨生红球藻源，10%）是可行的，添加0.10%～0.15%（即100～150 mg/kg）虾青素有助于豹纹鳃棘鲈鱼体色的增红，推动水产养殖行业的可持续发展，增加收益。