草食动物肠道厌氧真菌分离培养技术及其在农牧业的应用现状

■杨 闯 郭勇庆 王明月 高冲亚 孙宝丽

（华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642）

草食动物能够将难以消化的植物纤维通过胃肠道发酵转化成可利用的能量形式，这与栖息于它们瘤胃中数以万亿计的微生物作用密不可分。厌氧真菌（anaerobic fungi，AF）广泛存在于反刍动物瘤胃中，因此被习惯性地称为瘤胃真菌，由于后期在马、牛等肠道也发现了同样的厌氧真菌，因此，瘤胃厌氧真菌这一称呼也逐渐被肠道厌氧真菌（anaerobic gut fungi，AGF）所替代。AGF被认为是重要的瘤胃功能性微生物，这主要是由于它们可以作为植物饲料高效的降解剂，虽然AGF在胃肠道中仅占微生物总量的7%～9%，却能从植物性饲料中释放出超过50%的发酵糖类物质。AGF 能够产生各种形式的水解酶作用于植物纤维，使得它们成为植物性饲料消化的发起者，因而具有极高应用价值。然而，迄今为止，AGF 在现实中的应用并不是太理想，这主要是由于AGF 对氧高度敏感，使得无论是运输或是保存都成为令人头疼的问题。因此，优化分离培养以及保存技术在开发AGF利用价值方面显得格外重要。文章拟从AGF 菌株已鉴定属类现状、分离培养和保存技术以及AGF现阶段的应用潜力情况做简单综述，以期能够为相关科研人员在AGF探究过程中提供一些启发与帮助。

1 AGF的研究发展及形态学特征

AGF发现过程经历多个阶段，其种属的分类也随着生命科学技术的进步发生了不小的变化。1912年，相关研究在瘤胃中发现了AGF的存在，观测发现这种新微生物具有多鞭毛的结构，但受限于当时的技术，并未将这种新发现的微生物归类为真菌，而是归类为原虫，并命名为Callimastix cyclops；1913 年，相关研究在瘤胃中发现了在形态结构上类似的“原虫”，并将其命名为Callimastix frontalis；直到1975 年Orpin（1975）将C. frontalis重新培养，发现其具有真菌的特性，并将其重新命名为Neocallimastix frontalis，归类为藻菌纲（Phycomycetes）。至此，人们开始使用真菌的研究方式来探索AGF的奥秘。Orpin（1977）在该类生物细胞壁中发现了几丁质成分的存在，Barr（1988）认为该类微生物不应为藻菌类生物，而是真正的真菌，重新将该类生物归类为壶菌纲（Chytridiomycetes）。随着分子生物学的兴起，AGF 的分类更加细化。通过对核糖体RNA操纵子与蛋白质编码等基因以及其代谢特性进行分析，使得AGF以一个新的门类独立出来，形成新毛菌门（Neocallimastigomycota）。自1975 年首次确定AGF 后的40 年里，仅有6 个属为人们所鉴定与命名。随着鉴定技术的发展以及AGF 在植物细胞降解过程中的价值逐渐为人们所重视，近些年来，不断有新的AGF属类被鉴别与命名，且大多来源于野生反刍动物。

AGF的形态学特征是其属类划分的重要依据，根据Mountfort 在1994 年所描述的方式，属类划分在形态学方面的标准主要根据AGF是单中心或是多中心，假根形态以及游动孢子的鞭毛特点，而种的划分需要根据游动孢子的超微结构来确定。上述所提到属的形态学特点主要涉及的几个概念如下：首先，单或多中心AGF可根据真菌形成的孢子囊数量划分，单中心（monocentric）AGF 为仅产生1 个（簇）孢子囊，而多中心（polycentric）AGF 则会产生多个（簇）孢子囊，在生长过程中，单中心AGF 的细胞核不会迁移到假根中，而多中心AGF 的细胞核会迁移至假根中形成具核假根；其二是假根形态，丝状（filamentous）假根AGF 的假根会经历多次分支而形成类似于树根状的结构，而球状假根（bulbous）AGF 的假根会膨大形成球茎状假根结构；其三为游动孢子的鞭毛特点，根据游动孢子体表的鞭毛数量，可分为多鞭毛（polyflflagellate）游动孢子和单鞭毛（uniflflagellate）游动孢子，单鞭毛游动孢子的体表一般有1～4根鞭毛，而多鞭毛游动孢子一般有7～30根鞭毛。目前已分离鉴定的AGF名称及主要的形态学特点如表1所示。

表1 现阶段已分离鉴定的菌种

2 AGF分离培养技术现状

近5 年来，AGF 被鉴定与命名的数量快速增加，但这一数量远不足以揭示厌氧真菌在微生态中的多样性。AGF 鉴定的起始环节是要将菌体从其所处的生态中分离出来，而后经过扩增繁殖，才能通过各类方法进行鉴定分类。然而，由于AGF的严格厌氧特性且连续传代易衰老，在很大程度上限制了AGF 的发展，遑论其应用价值。下面简要介绍了现阶段AGF从样品采集、分离、培养以及保存与复苏方法的研究现状与注意事项，以期为AGF的分离鉴定以及应用价值的探索提供参考。

2.1 AGF样品的采集与分离

2.1.1 AGF样品的采集与富集

AGF 的样品来源主要是反刍动物的粪便以及瘤胃内容物，在采集过程中需尽可能装满取样管以排空氧气，采集后的样品应24 h内于冷藏条件下转移至实验室进行分离培养。获取的样品需要在厌氧工作台内打开，然后接种于高压蒸汽处理后的瘤胃液-纤维二糖（rumen-fluid-cellobiose, RFC）培养基内39 ℃富集24 h，其中纤维二糖可以使用0.5%的纤维素替代。当样品中AGF 达到一定数量后，可将富集好的AGF连续稀释5～10倍并分别接种于添加了1∶1纤维素和柳枝稷（Panicum virgatumL.）的厌氧瘤胃液（rumen fluid, RF）培养基内，39 ℃培养。由于AGF 常在植物表面定植，且在其生长过程产生的气体会导致培养基内的植物纤维上浮并发生颜色改变，因此该现象可以作为AGF 的生长旺盛的标志，也提示分离的最佳时期，一般72 h 左右出现上述现象。此外，培养基内可以加入抗生素以减少细菌对AGF生长过程中的干扰，Hanafy等（2018）在分离Feramyces austinii时推荐的抗生素组合为50 μg/mL 卡那霉素、50 μg/mL 青霉素、20 μg/mL链霉素以及50 μg/mL氯霉素。

2.1.2 亨氏滚管技术培养AGF

AGF的分离主要采用亨氏厌氧滚管技术，该方法由Hungate（1969）建立并于1969 年发表，该方法主要基于铜在高温条件下与玻璃管腔内氧气反应，进而制造出厌氧环境。经过处理后的亨氏管管腔内的氧气被消耗殆尽，使用特制耐热橡胶塞封闭开口后，便人工制造出适合AGF 生长的厌氧环境。将前文提到的培养完毕的AGF 使用生理盐水稀释后与琼脂培养基（RFC+2%琼脂）混合，使用无菌注射器接种于除氧后的亨氏管中，平放于滚管机中较低温度迅速滚动，使得管壁内混合AGF与培养基的液体凝固形成薄膜，而后置于39 ℃培养48～72 h，培养物在亨氏管内可以长期存活。

2.2 AGF的分离纯化与形态学观察

经上述方法培养后，可挑取形成的菌落接种于RFC培养基内扩增，需进行至少3轮的纯化与亨氏滚管培养以保证所分离菌群的纯度，直至所有培养管内的菌落形态一致。菌株需通过每2～3 周一次传代培养到RFC培养基中进行维持。

形态学观察方法可以用来判定所分离的AGF 真菌形态是否一致，可用于验证分离的纯度。主要使用光学显微镜或电子显微镜对生长在液体或者固体（加入2%琼脂来凝固）的RFC 培养基内的AGF 进行观察，通过鉴别假根形态、生长类型以及游动孢子的鞭毛数量来初步鉴定AGF。使用光学显微镜观察菌体结构时，可以使用乳酚棉蓝染色，使用激光共聚焦显微镜在微分干涉对比（DIC）模式下进行观察。为了使细胞核在光学显微镜下可视化，可以加入10 μg/mL的4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）并在暗室内孵育10 min，洗去多余的DAPI后，将玻片于暗室中风干，然后置于4%没食子酸正丙酯和90%甘油（V/V）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。电子显微镜观察菌体结构需将样品在室温下使用戊二醛中浸泡，而后使用四氧化锇固定、多梯度乙醇溶液脱水后干燥，最后使用Au-Pb溅射涂层，置于电子显微镜下观察。

2.3 AGF的保存与复苏

根据Bio-protocol 出版的《微生物组实验手册》中所描述，纯化后的AGF可使用稻秸培养基进行传代培养，培养过程中稻秸浮起即证明传代成功。取培养72 h 且稻秸浮起的培养管加入含有5%二甲基亚砜的纤维二糖培养基，并迅速转移至冻存管内冰浴5～10 min 后，-80 ℃冰箱过夜，隔天放入液氮进行中长期保存。复苏时可将冻存管于冰上解冻，而后将解冻后的稻秸置于加入0.1 mL 氯霉素溶液的纤维二糖培养基内，39 ℃培养72 h，培养期间内观察到稻秸浮起且形成菌膜则证明复苏成功。

3 草食动物AGF在甲烷生产与反刍动物饲养中的应用现状

3.1 AGF优秀的纤维降解作用

在研究的早期人们便发现，新摄入植物性饲料中血红素以及卟啉等各类植物成分会促进AGF 孢子的释放，且游动的孢子具有趋化作用，会向可溶性糖或酚酸丰富的区域聚集，在观察AGF 对黑麦草的作用时，发现AGF 会优先对植物的气孔或破损处进行侵袭，孢子萌发后会生长出根状组织从植物中汲取碳源以供菌体需要。体外试验也证实AGF 在瘤胃中对植物纤维的降解作用要远大于瘤胃中具有纤维降解能力的细菌。优秀的植物纤维降解能力要归功于AGF所产生的种类广泛的碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes，CAZymes）以及物理穿透能力，AGF的菌丝末端可以产生高浓度的纤维分解酶，这些酶类可以有效地降解植物细胞的纤维成分，其产物也为生态内的其他微生物提供了养分，因此AGF常被认为是植物性饲料降解的发起者。

AGF在降解纤维的过程中，除了能够形成多种游离的CAZymes外，还可以产生由各类纤维分解酶以及相关辅酶形成独有的纤维复合酶体（cellulosomes，也称纤维小体），这种纤维复合酶体是将多种纤维降解酶与相关的辅酶打包在一起，从而达到协作以高效水解纤维的效果。有研究表明，纤维素复合酶体的效率是游离状态下酶的12 倍。此外，AGF 还可以形成细胞结合态的纤维素复合酶体，主要位于假根的末端，配合假根的物理穿透能力，可以从多角度对植物细胞壁进行侵袭，以破坏植物细胞壁，完成纤维的分解过程。Hagen 等（2021）利用分子生物学手段对AGF 以及纤维分解细菌的CAZymes进行分析，发现瘤胃内的细菌所产生的CAZymes 主要作用于较易分解的半纤维素，而AGF 产生的CAZymes 主要针对难以降解的纤维素进行水解，因此二者可能会有互补作用。

3.2 AGF在产甲烷中的应用

AGF 优秀的纤维降解能力也使得其与产甲烷菌产生了十分紧密的共存关系。产甲烷菌同样严格厌氧，且只能利用一些结构较为简单的化合物（H2、CO2、HCOOH等）来合成甲烷，并在此过程中产生菌体生长所需要的能量，而AGF的代谢产物刚好可以产生产甲烷菌代谢所需要的大部分原料。产甲烷菌的代谢过程对于瘤胃发酵有十分重要的作用，他们大量利用氢，通过合成甲烷来消耗电子，维持氢浓度，促进纤维降解微生物对植物组织的降解。AGF严格厌氧，细胞内并不含线粒体，而是在细胞内生物隔膜形成的小区室-氢化酶体中进行底物水平磷酸化，进而产生代谢所需的ATP。在AGF代谢过程中，苹果酸和丙酮酸进入氢化酶体后会被代谢成为H2、CO2、甲酸和乙酸并产生ATP，而在与产甲烷菌共培养时，发现更多的苹果酸与丙酮酸进入了氢化酶体，促使产生更多的乙酸和ATP。这样的现象可能是由于产甲烷菌消耗了H2，而使得氢化酶受到的抑制减弱，促进了氢化酶体内NAD（P）H 生成H2的途径，进而使得更多碳水化合物被代谢成为乙酸和ATP，促进了AGF的生命活动。

AGF与产甲烷菌在瘤胃中共存使得反刍动物成为人为甲烷的重要来源，每年90 Tg（1 Tg=1012g）的甲烷排放量对于全球温室治理与畜牧业来说都是一个不可忽视的问题。而AGF 与产甲烷菌共培养可以快速将含有大量纤维的植物材料转化为甲烷，在农副产品能源开发领域中大有可为。工业上的厌氧发酵大多都存在木质素降解能力有限的问题，这是由于木质素类材料无论是物理结构还是化学性质都相对稳定，因此，生产沼气的首要步骤是对材料进行预处理。工业上常规用于处理木质材料的物理化学方法不但昂贵，而且废液的处理也是对环境不小的威胁。而使用AGF 与产甲烷菌共培养来发酵木质材料生产甲烷可以很好地代替传统物理化学处理方法，且在复杂的生物反应过程中，能够更加高效地生产甲烷，且减少了二次污染物的产生。产甲烷菌的存在也可以上调AGF对CAZymes的表达量，促进其对木质素的降解效率。各类报道也证明了AGF 与产甲烷菌共培养可以有效地提高甲烷生产效率：Wei等（2016）利用从牦牛体内分离的AGF与产甲烷菌进行简单的共培养，分别以小麦秸秆、玉米秸秆以及稻秸作为底物，经过7 d 的培养，分别产生了3.00、3.29 mmol/g以及3.15 mmol/g甲烷干物质；Shi等（2019）利用AGF 和产甲烷菌的共同培养来降解未经蒸汽爆破的玉米秸秆，便可生产出（37.10±1.09）mL甲烷。综上所述，AGF与产甲烷菌共同接种于植物原料来生产甲烷是一种十分高效的方式且对环境影响较小，同时也可以解决农副产品产量过剩的问题，但分离并筛选高效的AGF 与产甲烷菌组合的研究进展较为缓慢，在一定程度上制约了该技术的发展。

3.3 AGF在饲料处理及提升反刍动物健康中的作用

如前文所述，AGF可以产生一系列的酶类降解植物纤维，尤其引人注目的是其对木质材料等难消化纤维的降解能力，这也使得人们开始考虑应用AGF及其酶来改善低质量饲料，进而提升草食动物对低质量饲料的消化率。

资源合理化利用一直是人们的追求，在饲料资源匮乏的地区，将低质量饲料中的能量转化为高质量动物蛋白是十分有意义的。AGF的严格厌氧特点，也使得其在青贮贮藏过程中展现出了较大的潜力。Lee等（2015）分离筛选出3种纤维素分解活性高的菌株参与水稻秸秆青贮的发酵，分别测得10、30、60、90 d 和120 d 的干物质损失率以及纤维降解程度，结果表明AGF 处理后，稻秸青贮干物质损失率下降，且纤维降解程度显著提高；Wang 等（2019）在全株玉米青贮制作过程中以AGF作为添加剂，在发酵30 d后，发现接种AGF 提升了全株玉米的干物质回收率以及中性洗涤纤维（NDF）与酸性洗涤纤维（ADF）的消化率。然而，利用AGF进行饲料开发也存在着一定的制约，Ravi等（2021）研究了3 种厌氧真菌（Anaeromyces mucronatusYE505,Neocallimastix frontalis27,Piromyces rhizinflatusYM600）对玉米和芦苇木质素纤维水解的影响，并测定干物质损失率以及纤维降解程度等指标，但遗憾的是，3种不同类型的AGF对玉米以及芦苇纤维的水解并没有改善作用，这可能是由于发酵系统中AGF的存活率较低，提示在利用AGF 开发饲料的过程中，研究优化培养和工艺的重要性。

除饲料开发外，AGF也可以作为饲料添加剂提升反刍动物健康水平。Piromycessp. FNG5 菌株对反刍动物的益处早在2004年就被证实，其在瘤胃中降解纤维、提高有机物和纤维全肠道消化率的效果也让人们相信AGF 在饲料添加剂领域具有极大的潜力。但就目前而言，市面上较少甚至没有真正意义上的AGF饲料添加剂，其原因可能是由于AGF 对氧气高度敏感，需要人工采用极其迅速的方式令其抵达瘤胃，现阶段的方法（瘤胃插管、混拌后立即饲喂等）仅限于科学研究，很难大规模使用。当然，也可以采取封装的方式来降低AGF 与氧气的接触，以提高AGF 的存活率，Paul 等（2004）设计并封装了Neocallimaastixsp. CF-17，从而减少氧气对菌体的损害，成功地提高了水牛的生产性能，但封装的最佳效果只能持续12 h。虽然使用AGF 作为饲料添加剂工作量巨大且难以规模化使用，但AGF 仍然是一个未经大规模开发的宝库，且大多数可应用的AGF 菌来源于草食动物胃肠道中未驯化的菌种，因此野生反刍动物体内的AGF是一个十分有价值的益生菌库，或许存在着对氧气具有抗性且极具利用价值的菌种。

4 总结与展望

尽管AGF 进入人们的视野已经有百年之久，但受限于技术水平，直到20 世纪70 年代人们才对AGF有了较为正确的认识，且AGF的高度氧敏感性也使得人们对于AGF 的研究进展远落后于需氧真菌。近几年来，特别是2020年以来，被分离并鉴定的AGF数量急速增加，体现出人们越来越重视AGF重要的应用潜力。当前，AGF 主要在甲烷生产、饲料处理及提升动物健康中表现出巨大潜力。在甲烷生产方面，AGF与产甲烷菌复杂的互作关系可以有效提升甲烷的生产效率，且利用AGF处理发酵原料是一种对环境友好的办法，符合国家可持续发展战略。但AGF与产甲烷菌共培养应用于大规模生产还存在着许多制约：首先，AGF与产甲烷菌的具体协作关系并不十分明确，其具体的互作机制还有待更深入的研究；此外，AGF 与产甲烷菌的种类繁多，挑选出优秀的AGF与产甲烷菌组合对接生产，以提升甲烷生产效率还需要不断分离与验证。在饲料处理与动物健康提升方面，已经有许多学者证明AGF能够有效地促进动物的健康养殖、提升饲料利用率，但受限于AGF 高度厌氧的生理特性，导致很少有报道将AGF 真正应用于大规模实际生产之中，AGF封装技术或可成为解决其高度厌氧导致难以利用的一个突破口。

就现阶段的研究来看，AGF 的应用潜力虽然巨大，但其高度厌氧的特性也使我们距AGF的大规模应用仍有很长的路需要探索。对AGF的研究，无论是前文提及的筛选鉴定或是生理机制研究，都要以分离培养技术为基础。然而，现今人们对AGF的分离培养技术尚停留在较为原始的技术方法，这或许也是虽然AGF 在自然界中存在的数量、种类繁多，但能为人们所知晓的却十分稀少的原因之一。因此，推陈出新优化并制定出行之有效的分离培养方案，或成为了探索AGF 奥秘的首要任务。近些年来，虽然人们已经对AGF 的进化、生物学特性，以及生态学领域方面均有了进一步了解，但诸如AGF为何高度厌氧？AGF为何能够产生独有的纤维小体等？这些疑问让我们认识到人们对于AGF的了解仍然仅是冰山一角，但或许这些问题的答案在未来被揭晓时，AGF分离培养等方面的技术难题便能够真正被破解，进而使得AGF真正体现出其巨大的应用价值。