归芪益母口服液对两种细菌的抑菌效果和抗炎镇痛效果观察

■陈璟怡 王应燃 韩 雪 陈 勇 舒 刚*

（1.四川农业大学动物医学院，四川成都 611130；2.贵州省畜牧兽医研究所，贵州贵阳 550000；3.贵州凤和祥农业发展有限公司，贵州黔东南 557400）

归芪益母口服液为归芪益母汤组方所制兽药，归芪益母汤又名当归补血汤，出自《内外伤辨惑论》，由30 g黄芪和6 g当归组成处方，含有黄芪甲苷、藁本内酯、多糖、芒柄花素、阿魏酸、毛蕊异黄酮等有效成分，其中黄芪味甘、性温，能够发挥益气固表、补气升阳功效；当归同样味甘、性温，可以养血补血，并促进血液流通[1]。《牛经备要医方》是在当归补血汤的基础上，经过改良和添加益母草制成的，也被称为“归芪益母汤”[2]。归芪益母汤已在兽医临床取得广泛应用，该处方主要治疗母畜的气血两虚，疲劳引起的嗜睡、产后瘀滞、腹痛、失血和发烧。后来研究发现，归芪益母汤还可以极显著增强机体的缺氧耐受力[3]，归芪益母汤显著抑制机体制造O2的能力，也显著抑制了H2O2引起的细胞膜氧化溶血，降低自由基的产生，从而保证了组织的正常活力，可能还提高了小鼠对氧气的耐受能力。此外，黄芪的有效成分以多糖、皂苷、黄酮等成分为主，发挥抗衰老、抗感染、细胞保护、抑菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤和免疫增强等作用[4-5]。黄芪的抗菌作用表现在对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等都有较明显的抑制作用[6]，当归性辛、甘、温，其化学成分主要包括苯酚、香豆素、有机酸、氨基酸、多糖和类黄酮[7-8]，当归的有效成分可以抑制花生四烯酸代谢抗血小板聚集，干扰细胞内钙离子代谢，缓解血管平滑肌痉挛，以此缓解心脑缺血、动脉粥样硬化等疾病[9]。

当今规模化养殖时代，动物经常有细菌感染或炎症发生，如果仅仅只采用西医治疗，不仅会增加动物机体内残留的毒素，而且会导致抗药性和耐药性产生[10]，同时也可能使动物肉制品危害人的食品安全[11]。因此开发新的中兽药进行环保无害的治疗具有重要意义。虽然目前归芪益母口服液主要运用在母畜的产后护理上[12]，在抗菌抗炎镇痛方面实际运用的报道较少，但该组方中的单药（如当归、黄芪等）均被报道具有抗菌、消炎镇痛的药理活性，本试验旨在研究归芪益母口服液在动物抗细菌感染和消炎镇痛方面的作用效果，为归芪益母口服液开发新的用途，同时也为动物抗菌、消炎、镇痛方面用药提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌种

大肠杆菌菌株（ATCC 25922）、沙门氏菌菌株（ATCC 10398）由四川农业大学动物医学院实验室提供。

1.1.2 试验动物

SPF 级无特定病原体昆明（KM）雌性小鼠45 只（购自成都达硕生物科技有限公司）。

1.1.3 主要试剂归芪益母口服液（北京生泰尔生物科技有限公司提供，批号20200131，每毫升相当于1.2 g生药）。

1.1.4 主要仪器与设备

电热恒温培养箱（北京中兴伟业仪器有限公司）、超净工作台（苏州博莱尔净化设备有限公司）、热板仪等。

1.2 方法

1.2.1 体外抑菌试验

配制菌悬液：将冻存菌种进行活化处理，超净工作台紫外线照射15 min，使用75%乙醇棉球消毒包括手在内的所有物品。再将菌种倒入营养肉汤培养基中进行接种，在37 ℃的恒温培养箱中培养12 h，通过稀释涂布平板法确定菌液浓度。

抗菌活性初步筛选：抗菌活性最初的筛选是通过牛津杯法进行的[13]。用生理盐水将已知浓度的大肠杆菌和沙门氏菌溶液稀释至10-7，在营养琼脂板上，吸取200 μL 用涂布器均匀铺开，然后用无菌镊子将牛津杯均匀放置在板上，静置后取200 μL 归芪益母口服液，并针对每种细菌重复3组试验。在37 ℃环境培育平板12 h后，游标卡尺确定抑菌圈直径的大小。测试结果判断标准：极度敏感抑菌圈直径大于20 mm；高度敏感15～19 mm；中度敏感10～14 mm；小于10 mm是低敏感的；0 mm是不敏感的[14]。

最小抑菌浓度（MIC）的测定：倍比稀释归芪益母口服液，即用普通肉汤将抗菌药物稀释成不同的浓度梯度，然后接种待测细菌以定量确定最小抑菌浓度。即使用96孔板，向一排孔的1～12孔中添加100 μL营养肉汤，然后将100 μL归芪益母口服液添加到第1孔中，混合均匀取100 μL注入第2孔中混合后，混匀后取100 μL 移液到第3孔中，并按照此方法直到第10孔。以第11孔和第12孔中添加100 μL营养肉汤形成对照组。然后在第11孔中加入5 μL细菌悬液并充分混合，在孔12中加入等量的纯化水，于37 ℃培育24 h，并观察各孔中肉汤的澄清度。判断标准：肉汤是透明的，表明细菌没有生长；肉汤是混浊的，表明有细菌生长[15]。

最小杀菌浓度（MBC）的确定：将MIC测试中所述的无菌环境生成的肉汤100 μL吸取并滴入营养琼脂平板中，均匀铺开。同上37 ℃恒温培养箱培养24 h，观察是否有细菌生长。结果判定：最小杀菌浓度为无菌生长的最高稀释倍数[16]。

1.2.2 耳廓肿胀法

15只雌性小鼠被随机分为3组，每组5只，分别为试验组、阳性对照组和空白组。试验组、阳性对照组和空白组每日一次连续15 d灌胃归芪益母口服液、阿司匹林溶液和生理盐水，灌服剂量根据小鼠体重按0.4 mL/20 g。在最后一次给药30 min后，在小鼠右耳的两侧涂上二甲苯，并在涂抹处引起炎症1 h 后将其处死。沿耳廓的基线切开两只耳朵，在左耳和右耳上从对称部位使用直径为9 mm 的打孔器打孔并称重，以所得数据计算耳廓肿胀程度和对耳廓肿胀的抑制率，作为评价药物效果的指标[17]。

耳廓肿胀度=右耳廓重量（g）-左耳廓重量（g）

肿胀抑制率（%）=（空白组肿胀度-试验组肿胀度）/空白组肿胀度×100[18]

1.2.3 热板法

分组、剂量和给药方式与1.2.2 相同，连续给药15 d后，将小鼠放在（55.0±0.5）℃的热板仪上，观察小鼠从足底接触热板仪到出现舔后足状态，即热板反应的潜伏期，并记录潜伏期的时间长短作为疼痛阈值指标，在10 min和20 min后再次测量[19]。在正式测试之前，要去除反应潜伏期小于5 s 和大于30 s 的雌性小鼠，它们反应太敏感或太迟钝均为不合格。

1.2.4 醋酸扭体法

分组、剂量和给药方式与1.2.2 相同，连续给药15 d 后，向每组小鼠的腹腔中注入0.7%的冰醋酸（0.1 mL/10 g），通过伸展后肢、收缩腹部、抬高臀部等动作，判断小鼠出现扭体反应，并记录小鼠15 min 内的扭体次数，以计算出醋酸酸扭曲抑制率。

抑制率（%）=（空白组的次数-试验组的次数）/空白组的次数×100

2 结果与分析

2.1 抗菌活性试验

2.1.1 抑菌试验（见表1）由表1可知，归芪益母口服液对沙门氏菌有一定的抑菌作用，为中度敏感。

表1 归芪益母口服液的体外抑菌作用

2.1.2 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度（见表2）

表2 归芪益母口服液对菌种的MIC和MBC（g/mL）

由表2可知，归芪益母口服液对大肠杆菌的最小抑菌浓为0.250 g/mL，最小杀菌浓度为0.250 g/mL，对沙门氏菌的最小抑菌浓为0.125 g/mL，最小杀菌浓度为0.125 g/mL。该结果说明归芪益母口服液可对大肠杆菌和沙门氏菌发挥抑制作用。

2.2 抗炎镇痛试验

2.2.1 耳廓肿胀法（见表3）

表3 归芪益母口服液对二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀抑制效果

与空白组相比，归芪益母口服液和阿司匹林溶液都显著抑制了二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀(P＜0.05)，且归芪益母口服液的抗炎作用比阿司匹林弱。

2.2.2 热板法（见表4）

表4 归芪益母口服液对小鼠热板致痛的影响(s)

对小鼠热板舔足反应潜伏期的影响，试验组痛阈值显著大于空白组(P＜0.05)，且试验组的痛阈值大于阳性组。结果说明归芪益母口服液和阿司匹林都可以抑制小鼠舔后足的疼痛反应，同时归芪益母口服液的镇痛效果较好。

2.2.3 醋酸扭体法（见表5）

表5 归芪益母口服液对醋酸引起小鼠扭体次数的影响

与空白组相比，试验组和阳性对照组均可以显著抑制乙酸引起的小鼠疼痛反应(P＜0.05)。由表5 可知，试验组和阳性组对于空白组有显著差异，均能抑制乙酸引起的小鼠疼痛反应，归芪益母口服液的疗效更好，略优于阿司匹林。

3 讨论

中兽药取材于来源广泛的纯天然植物，天然植物不仅对动物生理功能没有明显毒副作用，也不对动物体产生明显损害，而且易于加工成散剂、丸剂、片剂、注射剂、栓剂、浸膏类制剂、汤剂等，易于对动物给药并各自具有优点，表现出良好低依赖性和临床效果。在兽医临床中发挥着很大的优势。归芪益母口服液主要由当归、黄芪、川芎、益母草、枳壳组成。李谷才等[20]经研究发现当归中的黄酮类提取物有一定抑菌活性，也有试验发现黄芪的皂苷类成分[21]和黄酮类[22]成分对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有较高的杀菌活性[23]。但在本次体外抑菌试验中，归芪益母口服液对大肠杆菌的抑菌效果不太理想，而对沙门氏菌抑菌圈直径达12.26 mm，为中度敏感，MIC 结果为0.125 g/mL，对沙门氏菌有一定抑制作用，且二者MBC试验中均表现出无杀菌活性，在杀菌方面效果不明显。由试验结果可见，归芪益母口服液对这两种细菌的体外抑菌效果较差，可能与生产加工过程或者组方配比等因素有关系。

归芪益母口服液暂未广泛应用于抗炎镇痛方面，但其组方的主要成分黄芪已被广泛报道于抗炎、抑菌的试验当中[24]，黄芪多糖能有效调节Toll样受体4（TLR4）信号通路的活性，诱导机体抗炎反应[25]，黄芪制剂也表现出良好的效果，如黄芪水提物对中性粒细胞具有明显的抗炎作用[26]，植物乳杆菌发酵的黄芪可作为天然的抗氧化、抗炎剂[27]，以黄芪为原料制成的纳米银颗粒具有较好的抗氧化活性（64%）[23]，添加黄芪且作为主要成分的归芪益母口服液也在试验中表现出良好的抗炎作用。同时研究也曾发现当归和川芎合用具有抗炎镇痛的作用[28]。本试验还将归芪益母口服液应用在炎症早期试验性肿胀、疼痛的抑制，观察其对抗炎镇痛的影响，来为产品的临床实际用药做出评估。在二甲苯法中与空白组有显著差异肿胀抑制率达到了50.82%，热板法小鼠痛阈值显著大于空白组，醋酸扭体法中与空白组有显著性差异，抑制率达到了62.82%。该试验结果表明归芪益母口服液能对各致炎因子所致小鼠炎症和疼痛有显著抑制作用，对炎症和疼痛有一定治疗效果。

4 结论

4.1 归芪益母口服液的抗菌效果

通过试验，证明归芪益母口服液作用于大肠杆菌时抑菌圈不明显，结果小于10.70 mm，抑菌效果较弱，最小抑菌、杀菌浓度为0.250 g/mL，杀菌活性较低。对沙门氏菌表现出较好抑菌效果，抑菌圈直径为12.26 mm，最小抑菌浓度为0.125 g/mL，但杀菌效果较弱。

4.2 归芪益母口服液的抗炎镇痛效果

通过试验，证明归芪益母口服液具有一定的抗炎镇痛效果。耳廓肿胀法中，肿胀抑制率有50.82%，热板法中痛阈值明显高于空白组，醋酸扭体法中抑制率有62.83%。