二代测序技术检测临床FFPE样本文库制备中的问题与对策

时姗姗，张智弘

二代测序(next generation sequencing, NGS)是继Sanger测序之后的一项革命性进步，能够同时对上百万甚至数十亿个DNA片段进行分析。目前NGS已广泛应用于基因突变的临床检测，有助于肿瘤患者找到有用的治疗靶点和预后标志物，实现真正意义上的“精准医疗”[1]。NGS分为实验操作和生物信息分析，包括众多实验处理和分析环节。病理科开展NGS检测主要采用FFPE样本。FFPE样本处理过程中无法避免会对DNA造成损伤，这增加了NGS技术在实际应用中的难度。本文总结了FFPE样本NGS实验操作中出现的常见问题，分析原因并给出相应的解决方案，现报道如下。

1 防止样本污染

防止样本污染是NGS操作中最基本的问题[2]。(1)PCR扩增产物：PCR经过数个循环后，产生数十亿个扩增产物。空气与液体面摩擦时，会形成气溶胶。NGS检测操作部分包括众多实验环节，需要多次开盖、换液，每一步都存在污染的风险。(2)试剂：反应试剂配制过程中，加样枪、容器、双蒸水等都存在污染的可能性。(3)标本间交叉污染：由于密封不严造成标本模板核酸外溢；或在提取过程中核酸模板随气溶胶或形成气溶胶扩散，从而导致标本间污染[3]。

针对上述问题，可采取以下方法：(1)NGS检测时，严格划分实验室工作区域，将PCR前后的步骤在空间上分开。针对低浓度游离DNA样本，为避免高浓度组织样本造成的交叉污染，需设置cfDNA专用的标本制备区和相应的扩增区域。(2)使用滤芯枪头，以防止移液过程中因加样枪造成的二次污染。(3)操作时只开单个样本，结束后立即关盖。严禁多样本同时开盖(图1A)。(4)开盖前，反应液离心，避免剧烈摇动反应管，以免因操作时飞溅形成气溶胶。(5)注意枪头盒、垃圾桶等摆放位置，并留意加样枪行驶的路径(图1B)。(6)所需试剂均应在生物安全柜、装有紫外灯的超净工作台或负压工作台内配制和分装。(7)操作器材专区专用，以降低不同实验间扩增产物交叉污染的风险。(8)实验结束后，生物安全柜、超净工作台或负压工作台及实验室需用紫外线消毒30 min以上。(9)定期检测实验室环境，以确保整个实验环境的洁净程度。整个操作过程中，操作人员应严格遵守操作SOP规程，最大程度地减少可能出现的的污染。

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2 注意DNA的浓度及质量

DNA的提取质量与后期文库构建、数据分析密切相关。病理科使用的经福尔马林固定、石蜡包埋处理的FFPE样本，存在多种因素干扰并影响DNA质量[4](表1)。研究发现10%中性福尔马林可以引起DNA片段化损伤，导致PCR扩增时可以扩增的模板量降低；同时降低PCR扩增酶的反应效率[5-6]。此外，长期暴露环境条件下的FFPE样本可诱导DNA碎片化[7]，从而造成NGS检测结果产生偏差[8]。

表1 FFPE样本对NGS结果造成的影响因素

样本的质控是靶向测序分析的基石。首先由病理医师进行病理质控，对肿瘤细胞进行富集(图2A)。在实验操作中应注意：(1)采用FFPE专用的核酸提取试剂盒，会对福尔马林诱导的修饰进行部分逆转[9]。(2)在进行PCR扩增前可以用尿嘧啶-DNA糖基化酶处理，减少因尿嘧啶损伤引入C>T, G>A等突变[8]。(3)FFPE样本制备及保存过程可能会产生DNA随机突变，造成单核苷酸变体(SNV)或插入/缺失(indels)。该误差可以通过加深测序深度及变体分析算法纠正[10]。(4)可以使用琼脂糖或核酸电泳仪对样本核酸完整性进行客观评价[11]。(5)针对低质量的样本，建议采取减少核酸打断时间及强度，或增加起始投入量来适度弥补文库丰度，或提高样本测序深度，扩大样本上机浓度等方式，以保证最终生成有效的数据量。穿刺、活检等小组织样本，建议：(1)处理时直接采取EP管收集，以减少后期刮片造成组织损失(图2B)；(2)提取DNA时可适当减少溶解液体积，以提高DNA浓度。

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此外，DNA浓度定量的准确性也至关重要。NGS过程中需多次对DNA浓度进行检测。紫外吸光度测量不具有选择性，灵敏度不足，不适用于NGS检测。因而采用荧光染料法，通过与特异性的靶分子结合时发出特殊荧光信号，可以对核酸进行精准定量[12]。定量操作要注意：(1)当样本中片段长度不均一，会与染料结合有差别，从而造成荧光值偏差。(2)荧光染料在不同的温度下荧光信号强弱有偏差。在低温时测出的值偏大，高温时测出的值偏小，整体误差范围约10%。针对上述问题，在实际DNA定量过程中建议：(1)DNA定量前，样本需要完全解冻成液体后，充分振荡混匀离心后进行检测。(2)每次检测前都需用标准品进行校正，重新制定标准曲线。(3)有条件的实验室可对样本采用复孔方式检测，以确保定量的准确性。

3 磁珠的使用

为了保证DNA的质量，在NGS检测过程中，文库需要多次纯化。目前通常采用磁珠纯化法，是一种固相载体可逆化固定的分离纯化方法。其主要原理为：磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料。在不同浓度的聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)中，DNA分子构象会发生急剧变化，由线状被压缩形成卷曲球状，继而聚集沉淀，吸附在磁珠的羧基修饰层上。随PEG分子量、浓度以及盐浓度的不同，不同长度的DNA可以被选择性沉淀出来[13]。在整个体系中，PEG浓度是影响DNA回收的决定性因素。因此，在纯化文库过程中使用磁珠需注意：(1)使用前充分混匀，室温平衡，这是保证PEG浓度的先决条件。可以通过观察样本磁珠混合液的颜色是否一致，确保混合均匀(图3A)。(2)在纯化过程中，采用70%～80%乙醇对磁珠进行清洗，需使用新鲜现配乙醇，以防止因挥发造成乙醇浓度的误差。(3)在磁珠静置过程中，需待溶液完全澄清，以免造成样本DNA损失。(4)在回收洗脱DNA时，一般根据磁珠的返光度判断磁珠的干燥状态(图3B)。残余量的乙醇会影响酶的活性从而减少后续PCR扩增的效能。

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NGS检测是一个极为复杂的过程，除了上述这些常见问题，同时需要确保每个环节的准确性。运用全面质量管理的理念，系统地识别并管理各个繁杂的阶段，以保证检测结果的真实性及有效性[14]。