EBV相关性胃癌21例临床病理学分析

张 蒙，王瑞芬，管雯斌，孙也淇，李凌轩，李俊磊，王立峰

胃癌是全球第五大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第四大原因[1-2]。研究发现EBV感染与胃癌有关。2014年癌症基因组图谱(TCGA)提出EBV相关性胃癌(EBV-associated gastric cancer, EBVaGC)是一种特殊的亚型，是免疫治疗的主要受益群体[3]。EBVaGC是一组具有显著临床病理学特点及独特基因改变的肿瘤。目前，国内报道的EBVaGC较少。本文回顾性分析21例EBVaGC的临床病理学特征，并结合相关文献探讨其治疗及预后，以提高病理医师对EBVaGC的认识。

1 材料与方法

1.1 材料收集2010年4月～2021年8月上海交通大学医学院附属新华医院576例胃癌根治性手术标本，由两名资深病理医师重新复阅切片。所有病例均行EBER原位杂交检测，筛选出EBVaGC标本21例。

1.2 方法

1.2.1HE及免疫组化 所有标本均经10%中性福尔马林固定，常规脱水、石蜡包埋、4 μm厚切片，行HE及免疫组化染色。免疫组化染色采用EnVision法，DAB显色，一抗包括MLH1、PMS2、MSH2、MSH6、HER-2，购自上海罗氏公司；PD-L1购自美国Cell Signaling Technology公司；Claudin-18.2购自北京中杉金桥公司。参照试剂盒说明书操作，使用Leica全自动染色机及罗氏公司Ventana Ultra全自动免疫组化染色仪染色。

1.2.2EBER原位杂交 使用罗氏公司Ventana Ultra全自动免疫组化染色仪进行EBER原位杂交。原位杂交蛋白酶、EBER探针、原位杂交蓝染染液和红色复染剂均为罗氏工作液。参照U INFORM iVIEW Blue ISH染色程序操作。在阳性对照细胞核着色良好的情况下，肿瘤细胞核着色为深蓝色记为阳性，以平均视野>5%的肿瘤细胞阳性且排除正常黏膜上皮细胞及间质淋巴细胞阳性，归类为EBVaGC[4]。

1.2.3FISH检测 对HER-2免疫组化2+者加做FISH检测，探针购自美国雅培公司，步骤参照试剂盒说明书操作。

1.3 结果判读

1.3.1错配修复蛋白(mismatch repair, MMR)免疫组化判读标准 在内对照(正常胃腺上皮及淋巴细胞等)细胞核着色良好的情况下，肿瘤细胞核出现棕黄色颗粒染色为阳性；4个蛋白均阳性为错配修复蛋白功能正常(mismatch repair-proficient, p-MMR)，至少一种蛋白阴性则判定为错配修复蛋白缺失(mismatch repair-deficient, d-MMR)。

1.3.2HER-2免疫组化判读标准 0：无着色或<10%肿瘤细胞膜染色；1+：≥10%肿瘤细胞微弱或隐约可见膜染色，或仅有部分细胞膜染色；2+：≥10%肿瘤细胞有弱到中度的基底侧膜、侧膜或完全性膜染色；3+：≥10%肿瘤细胞基底侧膜、侧膜或完全性膜强染色。参考2016版胃癌HER-2检测指南[5]，2+者须加做FISH检测。

1.3.3Claudin-18.2免疫组化判读标准 根据染色程度分为4级：无细胞膜或细胞质染色为0分，弱细胞膜或细胞质染色为1分，中等细胞膜或细胞质染色为2分，强细胞膜或细胞质染色为3分。以Claudin-18.2在≥40%肿瘤细胞染色程度≥2分定义为阳性[6]。

1.3.4PD-L1免疫组化判读标准 采用综合阳性评分(combined positive score, CPS)[7]，即CPS=(PD-L1阳性肿瘤细胞+PD-L1阳性肿瘤相关免疫细胞)/肿瘤细胞总数×100，CPS值≥1即为PD-L1阳性，反之为阴性。

1.3.5FISH HER-2基因扩增检测 在100倍油镜下观察胃癌细胞核，计数50个细胞，统计Ratio值，Ratio值=50个细胞核中红信号总数/50个细胞核中绿信号总数。Ratio值<1.8为阴性；>2.2为阳性；1.8～2.2时，可以选择增加计数细胞至100个，或重做实验进行判读。

1.4 统计学分析所有数据采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，一致性检验采用完全随机设计χ2检验及多个样本率比较的χ2检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征576例胃癌中检出EBVaGC 21例，占同期胃癌的3.6%，其中男性17例(81.0%)，女性4例(19.0%)。发病年龄42～74岁，平均61岁，中位年龄62岁；位于近端胃13例(61.9%)，远端胃8例(38.1%)；肿瘤最大径1.5～11 cm(表1)。

表1 EBV相关性胃癌21例临床病理学特征

2.2 组织学特征7例(33.3%)肿瘤细胞弥漫片状、小梁状分布，细胞多角形、合胞样，核空泡状，核膜明显，核分裂易见，间质内大量淋巴细胞浸润(图1)；7例(33.3%)肿瘤细胞排列成腺管状，细胞中等大小(图2)；少数病例肿瘤细胞核被黏液推挤至一旁形成印戒细胞。Lauren分型：肠型7例(33.3%)，弥漫型4例(19.0%)，混合型2例(9.5%)，不能确定型8例(38.1%)。WHO分型：伴淋巴样间质的癌7例(33.3%)；其他非伴淋巴样间质的癌14例(66.7%)：包括管状腺癌7例(33.3%)，低黏附性癌4例(19.0%)，混合性腺癌2例(9.5%)，未分化癌1例(4.8%)。

2.3 免疫表型及分子检测21例EBER原位杂交均显示肿瘤细胞核着色为深蓝色(图3、4)，其中5%

2.4 EBVaGC与non-EBVaGC临床病理特点比较EBVaGC和non-EBVaGC在发病部位、组织学类型、Lauren分型、PD-L1 CPS评分、肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。根据肿瘤细胞EBER阳性百分比将EBVaGC划分为5%0.05)。

2.5 治疗与预后21例患者均接受胃癌根治术并进行了D2淋巴结清扫，术后有8例患者行化疗。2例失访，5例死亡，14例生存，生存时间1.30～88.13个月。

3 讨论

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，在我国发病率仅次于肺癌和结肠癌[1,9]。自1990年Burke首次报道EBV阳性胃癌以来，越来越多的证据表明，部分胃癌的发生与EBV有关[10]。虽然EBV在成人中的感染率高达90%，但在胃癌中的感染率较低。2014年TCGA分子分型中EBVaGC约占9%，其发病率在各地区及人种之间有所不同，如北美白种人中EBVaGC发病率为16%，日本为7%；国内报道吉林省约7.6%、安徽省4.1%、北京3.9%、山东省2.1%[11-12]。本组中EBVaGC仅占比3.6%，与国内文献报道基本一致。目前，其地区及人种之间感染率差异的原因有待于进一步探讨[13]。

EBVaGC被定义为在肿瘤细胞中检测到EBV感染[14]，EBER原位杂交是诊断EBVaGC的金标准，但对于EBER阳性肿瘤细胞所占百分比目前尚未统一标准。根据肿瘤细胞EBER阳性百分比将EBVaGC划分为5%5%)肿瘤细胞显示EBER阳性，也可能有高的PD-L1 CPS评分和较好的预后。因此，建议对EBVaGC行PD-L1检测并将检测结果在报告中注明，为临床治疗提供指导。

①②③④⑤⑥⑦⑧

表2 EBV相关性胃癌与非EBV相关性胃癌性△临床病理特征比较[n(%)]

本实验发现EBVaGC与non-EBVaGC相比，其具有以下临床病理特点：(1)好发于近端胃，平均最大径5.5 cm。(2)Lauren分型以不能确定型最为常见，WHO分型以伴淋巴样间质的癌常见，但其他组织学亚型腺癌也可以检出EBV阳性[11]。在本组21例EBVaGC中，仅1/3病例为伴淋巴样间质的癌，仅根据组织学形态决定是否行EBER检测可能会导致部分EBVaGC漏诊。(3)肿瘤浸润程度浅，淋巴结转移率低，TNM分期早。(4)与non-EBVaGC相比，EBVaGC中PD-L1 CPS评分高(85.7%vs28.8%)，尤其在伴淋巴样间质的癌中PD-L1 CPS评分更高。(5)HER-2状态：本组21例EBVaGC免疫组化及FISH检测显示HER-2均无过表达和扩增，而对照组non-EBVaGC(162例，1例未做)中HER-2过表达者19例(11.7%)。此外，Bermudez等[15]报道在non-EBVaGC中16%病例表现出HER-2扩增；另有研究显示胃癌中HER-2过表达的发生率为13.4%[16]。上述研究表明：在EBVaGC中HER-2表达和HER-2扩增均受抑制。(6)Claudin-18.2表达：本组21例EBVaGC中Claudin-18.2阳性率47.6%。目前，我国关于Claudin-18.2在胃癌中的表达数据较少，查阅相关文献[2,17-18]发现，在高加索人中EBVaGC的阳性率为77.7%，non-EBVaGC的阳性率为32.4%；在日本人群中EBVaGC的阳性率为84%，non-EBVaGC的阳性率为40%。尽管本实验数据与文献报道有差异(推测可能与不同抗体克隆号、不同人种及不同阳性标准有关)，但Claudin-18.2在EBVaGC中的阳性率高于non-EBVaGC。此外，有学者报道在TCGA 4种分子亚型中，EBV亚型中Claudin-18.2的阳性率最高[2]。(7)4种MMR均无缺失，与文献报道相符[19]。

目前，关于EBVaGC患者预后的研究结果不同。多项研究支持EBV感染是预后较好的因素，其中TCGA数据库的一项研究显示EBVaGC比其他分子亚型预后好[20]。此外，一项整合了东西方的超大样本(375/4 244，8.2%)临床数据也显示EBVaGC患者的生存期更长[21-22]。然而，少数研究发现EBVaGC与non-EBVaGC患者的预后差异无统计学意义，可能与以下原因有关：(1)样本量小，一些患者尚未出现终点事件，删失数据多，差异不显著。(2)样本内一些患者具有特殊的分子改变，如TP53[23]、BCOR突变[24]，具有这些分子改变的患者预后差且免疫治疗效果不佳。本组中19例获得随访，5例患者死亡，组织学类型均为非伴淋巴样间质的癌，且有3例PD-L1 CPS<1，另2例PD-L1 CPS为2，生存时间1.3～51.67个月，提示在EBVaGC中组织学类型为淋巴样间质的癌，PD-L1 CPS评分高者常伴有良好的预后[25]。

目前，PD-L1免疫检查点阻断剂在治疗胃癌方面发挥着越来越重要的作用。在2021年CSCO胃癌诊疗指南[26]中，对于HER-2扩增阴性的转移性胃癌，PD-L1免疫治疗已上升至一线治疗(PD-L1 CPS≥1三级推荐，PD-L1 CPS≥5一级推荐)。有文献报道HER-2阳性胃癌和EBVaGC之间无交叉[27]；本组21例HER-2均无扩增，提示PD-L1阻断剂如帕博利珠单抗在胃癌(尤其是EBVaGC)治疗中发挥越来越重要的作用[28-29]。

Claudin-18.2是Claudin家族的一员，是紧密连接的组成部分，可以调节细胞外屏障功能。Dottermusch等[18]研究发现，胃癌中Claudin-18.2表达与EBV感染状态有关，并认为肿瘤细胞中Claudin-18.2表达可能与EBV介导的致癌机制有关。本组21例EBVaGC中47.6%病例Claudin-18.2阳性，提示EBVaGC中Claudin-18.2高表达有望成为新的潜在治疗靶点[30-31]。

综上所述，EBVaGC是一种具有独特临床病理特征的胃癌，好发于男性、近端胃、TNM分期早、淋巴结转移率低、PD-L1 CPS评分高，约1/3病例为伴淋巴样间质的癌。此外，与non-EBVaGC相比，EBVaGC中PD-L1 CPS评分高，Claudin-18.2阳性率高，HER-2扩增受抑制。尽管EBVaGC预后有争议，但绝大多数文献均支持该亚型预后好，生存时间长。PD-L1免疫检查点阻断剂和Claudin-18.2靶向药的应用，将使更多的EBVaGC患者获益[32]。