新疆地区光果甘草与胀果甘草化学成分差异的多元统计分析△

陈佳，聂黎行，戴胜云，刘薇，魏锋，马双成

中国食品药品检定研究院，北京 102629

甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、胀果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根茎，在我国有悠久的使用历史，近60%的中药成方制剂中含有甘草[1]。甘草具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效[2]，《神农本草经》将其列为上品，又名“国老”。据本草考证，历代古籍所描述的甘草基原为甘草G.uralensisFisch.，多产于宁夏、内蒙古、陕西、甘肃一带，以“梁外甘草”为最佳，即内蒙古鄂尔多斯杭锦旗梁外地区[3-5]。新疆地区甘草主要包括3 种基原，分别是甘草G.uralensisFisch.、胀果甘草G.inflataBat.和光果甘草G.glabraL.，其中胀果甘草系新疆地区特有的甘草药用资源，主要分布于新疆的南疆塔里木盆地和东疆哈密、吐鲁番地区及塔里木河及孔雀河流域等地区[6]。光果甘草主产于中东及地中海地区，在我国主要分布在新疆北部及甘肃等地区[7-8]。

本课题组前期研究对甘草G.uralensisFisch.化学成分进行了详细分析[9]，本实验在前期研究基础上，针对新疆地区光果甘草和胀果甘草化学成分进行分析和探讨。目前关于胀果甘草和光果甘草化学成分的研究报道很多，大多针对其中1 种基原开展深入研究[10-11]，也有相关报道对胀果甘草和光果甘草进行化学成分对比研究，如含量测定方法的建立[12]、三萜皂苷类或黄酮类化合物的含量分析[13-14]、不同基原甘草的化学成分差异探讨[15]等。本实验采用高效液相色谱法（HPLC）测定了光果甘草和胀果甘草不同结构类型的20个化学成分（2个三萜皂苷类、2个香豆素类、3 个查耳酮类、13 个黄酮类化合物）含量，并运用多元统计分析，找出光果甘草和胀果甘草之间的差异化学成分，为多基原甘草药材质量评价及相关标准制定提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters e2695 型高效液相色谱仪（2998 二极管阵列检测器、Empower 网络版工作站）；KQ-250DE型医用数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XSE 205DU 型电子天平（梅特勒-托利多仪器公司）。

1.2 试剂

对照品甘草酸铵（批号：110731-202021，纯度：96.20%）、甘草苷（批号：111640-201908，纯度：95.00%）、芒柄花素（批号：111703-201504，纯度：95.00%）均来自中国食品药品检定研究院；甘草皂苷G2（批号：PCS200904，纯度：98.59%）购自成都植标化纯生物技术有限公司；甘草异黄酮B（批号：PS20110202，纯度：98.02%）、甘草酚（批号：PS010089，纯度：98.71%）均购自成都普思科技股份有限公司；半甘草异黄酮B（批号：MUST20072104，纯度：99.91%）、甘草黄酮醇（批号：MUST20041311，纯度：98.86%）均购自成都曼思特生物科技有限公司；芹糖甘草苷（批号：PRF9050224，纯度：99.95%）、芹糖异甘草苷（批号：PRF9101021，纯度：97.04%）、甘草素（批号：PRF20042742，纯度：99.50%）、异甘草素（批号：PRF20060943，纯度：99.87%）、光甘草酚（批号：PRF20032401，纯度：99.95%）、刺甘草查耳酮（批号：PRF10122621，纯度：99.81%）、异甘草苷（批号：PRF20040923，纯度：98.23%）、新异甘草苷（批号：PRF20060942，纯度：99.25%）、甘草香豆素（批号：PRF20060921，纯度：99.77%）、甘草查耳酮A（批号：PRF20033022，纯度：98.57%）、甘草查耳酮B（批号：PRF10101021，纯度：99.74%）、佛来心苷（批号：PRF9110601，纯度：95.77%）均购自成都普瑞法科技开发有限公司；甲酸、乙腈均为色谱纯；纯净水为Milli-Q 超纯水，其他试剂均为分析纯。

10批胀果甘草（S1～S10）及10批光果甘草（S11～S20）样品经中国食品药品检定研究院中药标本馆张南平主任药师鉴定，分别为豆科植物光果甘草Glycyrrhiza glabraL.及胀果甘草G.inflataBat.的干燥根和根茎，见表1。样品保存于中国食品药品检定研究院中药民族药检定所中药标本馆。

表1 光果甘草及胀果甘草药材信息

2 方法

2.1 光果甘草与胀果甘草中16个化合物含量测定

2.1.1 色谱条件 Shiseido Capcell Pak MG C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱。甘草查耳酮B、刺甘草查耳酮、甘草查耳酮A 及光甘草酚洗脱梯度为：0～30 min，25%～70%A；30～34 min，70%A；34～35 min，70%～95%A；35～40 min，95%A；40～41 min，95%～25%A；41～45 min，25%A。其余16 个化合物洗脱梯度为0～60 min，5%～95%A；60～65 min，95%A；65.0～65.2 min，95%～5%A；65.2～75.0 min，5%A。流速为1 mL·min-1。柱温为40 ℃。进样量为10 μL。检测波长为250 nm（芒柄花素、甘草酸和甘草皂苷G2）、262 nm（半甘草异黄酮B 和甘草异黄酮B）、275 nm（甘草苷、芹糖甘草苷和甘草素）、360 nm（佛来心苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、新异甘草苷、异甘草素、甘草香豆素、甘草酚、甘草黄酮醇、甘草查耳酮B、刺甘草查耳酮和甘草查耳酮A）、282 nm（光甘草酚）[9,16]。色谱图见图1～2。

图1 甘草药材16个化学成分HPLC图

图2 甘草药材4个化学成分HPLC图

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取甘草皂苷G2、甘草酸铵、芒柄花素、半甘草异黄酮B、甘草异黄酮B、芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、佛来心苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、新异甘草苷、异甘草素、甘草香豆素、甘草酚及甘草黄酮醇对照品适量，加甲醇溶解并稀释成质量浓度分别为46.26、182.20、4.16、11.63、9.17、116.05、90.44、15.70、5.47、36.54、19.96、11.36、4.62、8.06、14.00、4.40 μg·mL-1的混合对照品溶液1。

精密称取甘草查耳酮B、刺甘草查耳酮、甘草查耳酮A及光甘草酚对照品适量，加甲醇溶解并稀释成质量浓度分别为21.48、2.87、43.90、18.66 μg·mL-1的混合对照品溶液2，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称量，超声（超声功率：300 W，频率：40 kHz）处理30 min，放冷，再称量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液1。

取本品粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称量，超声（超声功率：300 W，频率：40 kHz）处理45 min，放冷，再称量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液2。

2.1.4 方法学验证 依据课题组已建立的HPLC 方法[9,16]，经方法学验证，20 个化合物的线性相关系数（r）均大于0.999 4，检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.002 7～0.062 8 μg·mL-1和0.008 8～0.209 2 μg·mL-1，加样回收率为91.19%～101.25%，稳定性、精密度和重复性RSD 分别为2.92%、1.00%和2.33%。方法学验证结果符合《中华人民共和国药典》2020 年版（四部）通则9101《药品质量标准分析方法验证指导原则》。

2.2 数据分析

聚类分析（HCA）和主成分分析（PCA）采用ChemPattern 2017 化学计量学软件；t检验采用SPSS Statistics 23.0 软件；正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）采用SIMCA 13.0软件。

3 结果

3.1 光果甘草与胀果甘草中20个化合物含量

采用外标法计算20批甘草样品中20个化合物含量，见表2。分别统计光果甘草与胀果甘草中20 个化合物含量，结果见图3。

图3 胀果甘草和光果甘草中20个化学成分含量分布（n=10）

表2 甘草药材中20个化学成分质量分数（n=20）%

3.2 HCA

利用Chem Pattern 软件将光果甘草和胀果甘草20 个化学成分含量数据标准化后，以欧式距离为度量，采用远邻法进行聚类分析，见图4。由图4 可知，光果甘草和胀果甘草可以各自聚为一类。

图4 光果甘草和胀果甘草20个化学成分含量的HCA

3.3 PCA

以20个化学成分含量为变量，采用ChemPattern软件进行主成分分析，见图5。第一主成分（PC1）的方差贡献率为73.30%，第二主成分（PC2）的方差贡献率为18.59%，累积方差贡献率为91.89%，说明其能较好地反映样品间的差异。PCA 散点图显示，光果甘草和胀果甘草可以各自聚为一类，该结果与聚类分析结果相符。

图5 光果甘草和胀果甘草20个化学成分含量的PCA

3.4 OPLS-DA

采用SIMCA 13.0 软件，以20 个化学成分含量为自变量，20批样品为因变量，进行OPLS-DA。由图6 可以看出，2 种基原的甘草药材可以较好地区分，胀果甘草（S1～S10）集中分布于模型左侧，光果甘草（S11～S20）集中分布于模型右侧，OPLSDA 分类结果与HCA、PCA 结果一致[17-21]。采用交叉验证法对模型进行验证，模型对自变量拟合指数R2X=0.6，对因变量的拟合指标R2Y=0.915，模型预测指数Q2=0.802，三者均大于0.5，说明模型稳定可靠，可用于光果甘草和胀果甘草的区分。

图6 光果甘草和胀果甘草20个化学成分含量的OPLS-DA

为进一步找出影响2 种基原甘草药材差异的主要变量，得到了OPLS-DA 模型的变量重要性投影（VIP）值，见表3。VIP值的大小代表了各指标成分对模型贡献率的大小，值越大贡献越大。以VIP值＞1为界限进行筛选，新异甘草苷、异甘草苷、甘草查耳酮A、甘草苷、甘草酚、甘草皂苷G2、异甘草素和甘草查耳酮B 是影响光果甘草和胀果甘草差异的主要化学成分，对2 种基原甘草区分的影响程度为新异甘草苷＞异甘草苷＞甘草查耳酮A＞甘草苷＞甘草酚＞甘草皂苷G2＞异甘草素＞甘草查耳酮B。

3.5 t检验

为验证经OPLS-DA 找到的2 个基原甘草差异化学成分的准确性，采用SPSS Statistics 23.0软件，按照基原类别将20 批样品分为2 类，并以样本类别为自变量，20个化学成分含量测定结果为因变量进行t检验，结果见表3[22]。新异甘草苷、异甘草苷、甘草查耳酮A、甘草苷、甘草酚、甘草皂苷G2、刺甘草查耳酮和异甘草素的含量在光果甘草和胀果甘草中差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 光果甘草和胀果甘草20个化学成分含量OPLS-DA VIP值和t检验P值

对2 种统计方法的分析结果进行综合分析，发现新异甘草苷、异甘草苷、甘草查耳酮A、甘草苷、甘草酚、甘草皂苷G2及异甘草素既对2 种基原甘草药材OPLS-DA 模型贡献大（VIP 值＞1），又在t检验中差异有统计学意义（P＜0.05）；甘草查耳酮B虽在OPLS-DA 中对模型贡献大（VIP 值＞1），但在t检验中差异无统计学意义；刺甘草查耳酮虽在t检验中差异有统计学意义（P＜0.05），但在OPLS-DA 中对模型贡献较小（VIP值＜1）；甘草香豆素、甘草异黄酮B、光甘草酚、佛来心苷、甘草黄酮醇、甘草素、芒柄花素、芹糖甘草苷、半甘草异黄酮B、甘草酸和芹糖异甘草苷既对OPLS-DA模型贡献较小（VIP值＜1），又在t检验中差异无统计学意义。故将新异甘草苷、异甘草苷、甘草查耳酮A、甘草苷、甘草酚、甘草皂苷G2及异甘草素7 个化学成分作为区分2 个基原甘草药材的差异化学成分。

4 讨论

4.1 待测化学成分的选择

甘草化学成分较复杂，以黄酮类和三萜皂苷类化学成分为主，另有香豆素类、二苯乙烯类等其他结构类型的化学成分，不同结构类型的化学成分药理作用有所不同[23-24]。已有研究表明，光甘草定是光果甘草的特征化学成分，也是主要化学成分[25-26]，但光果甘草中其他化学成分的研究报道较少。本研究选择黄酮类、三萜皂苷类、香豆素类等不同结构类型的20 个化学成分作为研究对象，发现光果甘草和胀果甘草的差异化学成分包括4 个黄酮类化合物、1 个三萜皂苷类化合物、1 个香豆素类化合物和1 个查耳酮类化合物，说明不同结构类型的化合物含量在2个基原的甘草药材中均存在不同程度的差异。

4.2 统计结果分析

本研究通过OPLS-DA 寻找光果甘草和胀果甘草的差异化学成分，发现甘草查耳酮B 在OPLS-DA 中VIP值＞1，初步认为该化合物在2个基原甘草药材中含量是有差异的，再采用t检验验证发现，甘草查耳酮B 在2 个基原甘草药材中的含量差异无统计学意义。采用同样的统计方法，发现新异甘草苷等7 个化学成分既在OPLS-DA 中VIP＞1，即对该模型贡献大，又经t检验验证发现其在2 个基原甘草药材中的含量差异有统计学意义，因此最终确定该7 个化学成分是光果甘草和胀果甘草的差异化学成分。

4.3 差异化学成分分析

本研究找到的7 个差异化学成分在光果甘草和胀果甘草中均能检出，属于含量高低的区别。甘草查耳酮A 在胀果甘草中的含量高于光果甘草，甘草苷、异甘草苷和异甘草素在光果甘草中的含量高于胀果甘草，这与已有文献报道一致[11,27]。本研究发现，新异甘草苷在光果甘草和胀果甘草中的含量差异有统计学意义，其在光果甘草中的含量高于胀果甘草。本课题组前期研究发现，新异甘草苷在甘草清热解毒功效方面具有潜在生物活性[23]，此外，在不同生长年限甘草中的含量也具有显著差异[28]，本课题组将对该化学成分开展深入研究，进一步考察其作为不同基原甘草药材质量控制指标的可能性。

本课题组在前期研究中发现，甘草与胀果甘草和光果甘草存在明显的化学成分差异。本研究进一步分析了胀果甘草和光果甘草化学成分的差异，发现甘草查耳酮A 等7 个化学成分在胀果甘草和光果甘草中差异有统计学意义。胀果甘草富含甘草查耳酮类成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等作用，常被用于制备甘草提取物。光果甘草黄酮类成分具有抗炎及抑制酪氨酸酶的活性，是良好的黑色素抑制剂，常被用作美白类化妆品原料[29-31]。本研究结果为多基原甘草药材质量评价及相关标准制定提供科学依据，同时也为多基原甘草药材综合开发利用提供参考。