二次回归正交旋转组合设计优化香蕉浆护色工艺

李宝深，王 斌，韦绍龙，李朝生，覃柳燕，黄素梅，韦 弟

(1 广西农业科学院生物技术研究所，南宁，530007；2 中国农业大学资源与环境学院，北京，100093)

香蕉浆是香蕉加工产品的半成品，多作为婴幼儿辅食、冰激凌、风味牛奶以及烘培糕点等食品的基本原料，不仅能够最大程度地保留香蕉营养成分和风味物质，同时能够满足香蕉长时间运输及贮藏。香蕉经过打浆之后经过高温灭酶、负压脱气、高压均质和超高温杀菌之后，得到成品香蕉浆。香蕉在加工过程中面临最大的问题是褐变[1]，其中酶促褐变是主要因素[2]，这主要与香蕉中富含大量的酚类物质有关。据报道，成熟香蕉果肉中总酚含量高达459.3 mg/L[3]。参与酶促褐变的酶主要有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)，其中以多酚氧化酶为主。

多酚氧化酶是一类含铜的氧化还原酶，催化邻-苯二酚氧化成邻-苯二醌，也能作用于单酚单加氧酶的底物，氧化形成不稳定的邻-苯醌类化合物，再进一步通过非酶氧化反应，聚合成黑色素。褐变一方面对于食品外观造成不良的影响；另一方面，当邻苯醌与蛋白质中赖氨酸残基的ε-氨基反应，可引起蛋白质营养价值和溶解度下降，造成食品营养和风味变化。引起褐变的3个必要条件是多酚类物质、多酚氧化酶和O2。从食品中去除多酚类物质不现实，因此只能够通过降低多酚氧化酶的活性或者降低氧气含量来抑制酶促褐变的发生。降低溶氧量主要通过氮气保护[4]、添加1%～2%食盐[5]或者一定量的蔗糖[6]等具有高渗透压的物料，来降低物料中的溶氧量，同样也可以使多酚氧化酶因脱水而失活。生产上常常采用高温热烫的方法来达到灭酶的效果，多酚氧化酶最适温度25～40 ℃，目前大部分加工工艺采用100 ℃水浴处理20～30 s来钝化多酚氧化酶的活性[7]。

生产工艺的确定往往是多因素相互影响的结果。响应面分析法(Response Surface Methodology)利用合理的试验设计，采用多元二次回归方法作为函数估计的工具，将多因子实验中因素与指标的相互关系用多项式公式进行拟合，根据公式能够得到函数的响应面和等高线分析，能够用于研究因子和响应面之间以及因子和因子之间的相互关系[8]，该方法已经被广泛应用[9-10]。相比正交实验设计法，该方法所求得的回归方程精度较高，同时具有能够研究多个因素之间的相互作用的优点[11]。本研究采用响应面分析法对打浆护色过程中柠檬酸、D-异抗坏血酸钠添加量以及水与果肉比进行研究，以此来提高香蕉护色效果，为香蕉打浆护色生产工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

南宁市隆安县香蕉种植基地香蕉经过催熟至果皮全黄备用。柠檬酸、D-异抗坏血酸钠均为AR级。试验设备包括3nh NR110 手持色差仪，深圳市三恩驰科技有限公司产；JA12002精密电子天平，日本岛津产；MJ-25BM05A水果打浆机，广东美的精品电器制造有限公司产；STARTER 3100/F pH计(OHAUS)；MM721NG1-PW美的微波炉，广东美的厨房电器制造有限公司产；FJ200 高速分散均质机，上海标本模型厂产；HH-S6 金怡数显恒温水浴锅，江苏省金坛市医疗仪器厂产。

1.2 方法

1.2.1 香蕉浆制备及护色效果评价方法 香蕉浆加工工艺流程见图1。将同一批次香蕉催熟后剥皮，按照果肉质量，计算添加水和护色剂量，将护色剂溶解在水中，连同香蕉一起进行打浆10 s；打浆完成后迅速转移至烧杯中，用均质机中高速匀浆2 min；沸水浴加热10 min使酶完全失活。采用褐变指数(Browning index，简称BI)来表征褐色纯度，能够反映水果在酶促褐变和非酶促褐变过程中的颜色变化。根据L*a*b*表色系统，利用色差仪反射模式对香蕉浆色差参数进行测定。BI计算方法参考Palou等[12]，BI=100(x-0.31)/0.172，其中x= (a*+1.75L*)/(5.645L*+a*-3.012b*)，BI值越小，褐变程度越大。

图1 香蕉浆加工工艺流程

1.2.2 香蕉浆pH值测定方法 先用标准溶液进行校正，分别标定pH值6.86、4.01和9.18的标准溶液，校正之后，把pH计电极头直接插入各样品中，待读数稳定后即为香蕉浆样品pH值。

1.2.3 香蕉打浆护色工艺单因素试验 分别对水与果肉比、柠檬酸添加量和D-异抗坏血酸钠添加量对香蕉打浆护色效果的影响进行单因素试验。

1.2.4 香蕉打浆护色工艺优化 根据单因素试验结果，确定各因素水平范围，再进行二次回归旋转组合设计，采用Design-Expert 8.0.6及Excel 2010软件进行响应面分析，通过响应面拟合的方程得出香蕉打浆护色过程中最优工艺条件。

2 结果与分析

2.1 单因素对护色效果的影响

2.1.1 柠檬酸添加量 固定水与果肉比为0.08，D-异抗坏血酸钠添加量为0.10%，研究柠檬酸添加量对香蕉打浆护色效果的影响。由图2可知，香蕉浆的褐变指数随着柠檬酸添加量的增多而逐渐增大，柠檬酸添加量增加，降低体系pH值，抑制了多酚氧化酶的活性，使得香蕉浆的褐变指数逐渐增大。随着柠檬酸添加量的增加，香蕉浆的口感也变得越来越酸，柠檬酸添加量达到0.30%时，体系pH值降低至4.04，此时香蕉浆口感略有酸涩，并且在柠檬酸添加量达到0.30%后，香蕉浆的褐变指数增加不显著，因此柠檬酸添加量选择0.30%较适宜。

图2 柠檬酸添加量对香蕉浆护色和pH值影响

2.1.2 D-异抗坏血酸钠添加量 固定水与果肉比为0.08，柠檬酸添加量0.10%，研究D-异抗坏血酸钠添加量对香蕉护色效果的影响。D-异抗坏血酸钠具有较强的还原性，能够将褐变过程中生成的琨类物质直接还原，甚至能够被多酚氧化酶直接氧化，因此能够显著抑制香蕉浆的褐变。由图3可知，D-异抗坏血酸钠添加量0.20%以内，随着D-异抗坏血酸钠添加量增加，香蕉浆褐变指数逐渐增加；当D-异抗坏血酸钠添加量大于0.20%后，香蕉浆褐变指数反而逐渐降低。可能由于D-异抗坏血酸钠添加量增加提高了体系pH值，从而减弱了柠檬酸的护色作用；且D-异抗坏血酸钠添加量增加，经过高温加热后，会引起D-异抗坏血酸钠参与的美拉德反应，加速香蕉浆的褐变。因此D-异抗坏血酸钠添加量选择0.20%较为合适。

图3 D-异抗坏血酸钠添加量和水与果肉比对香蕉浆褐变指数的影响

2.1.3 水与果肉比 固定柠檬酸添加量0.10%，D-异抗坏血酸钠添加量0.10%，研究水与果肉比对香蕉浆护色效果的影响。香蕉浆的黏度较大，香蕉打浆过程中加水量增加能够使得香蕉浆与护色剂充分接触，并起到香蕉护色效果。由图3可以看出，随着加水量的增加，香蕉浆褐变指数不断升高。当水与果肉比为0.08，褐变指数增加幅度较小，因此初步确定最佳水与果肉比为0.08。

2.2 二次旋转正交组合试验分析

根据单因素试验结果，选择各个单因素条件下最佳工艺条件进行二次回归正交旋转组合设计，设计因素水平编码表见表1。

表1 香蕉浆护色工艺二次回归正交旋转组合设计因素和水平编码

根据软件Design-Expert 8设计的试验方案进行试验，结果见表2。

表2 香蕉浆护色工艺二次回归正交旋转组合试验设计及结果

由表3可知，回归方程的失拟项检验p=0.191 2>0.05不显著，因此可以说明方程合理，所选择的回归模型是合适的。定义p<0.05为显著，回归项显著性检验p=0.019 8<0.05显著，失拟项显著性检验p=0.191 2>0.05不显著，说明建立的回归模型与现实情况吻合较好，模型能够成立。同时B、AC、C2的模拟系数具有良好的显著性。

表3 香蕉浆护色工艺二次回归正交旋转组合试验设计方差分析

多项方差分析结果看出，标准偏差为3.02，平均值53.06，变异系数5.69%，多元相关系数R2=0.952 6，调整后R2=0.910 0，预测R2=0.769 8，表明模拟系数的相关性良好。信噪比为15.328>4，表明有充分的信号强度。方差分析表明此模型可以被应用。根据编码因子所得最终模拟方程为：Y(即BI值)=-128.97+425.07A+134.05B+309.63C-197.25AB-228.13AC-24.19BC-496.06A2-70.27B2-157.78C2。

Design-Expert利用模拟所得到的拟合方程，以褐变指数为响应值，固定3个因素中其中1个因素为中心水平，即“0”水平，以另外两个因素为自变量，绘制响应面和等高线(见图4)，可以得出两两因素交互作用对打浆过程中褐变指数的影响。根据模拟方程可以得到香蕉打浆护色最佳工艺条件为：D-异抗坏血酸钠添加量为0.13%，柠檬酸添加量为0.50%，水与果肉比为0.085，此时香蕉浆的褐变指数为69.78。采用此条件对香蕉浆进行护色试验，得到香蕉浆的褐变指数为68.46，与优化理论值相对误差为1.89%。

图4 香蕉浆护色工艺各因素交互作用的响应面和等高线

3 结论与讨论

除了降低物料中溶氧量和热烫的工艺，也可以通过降低酚酶的活性来抑制褐变。研究表明，多酚氧化酶等氧化酚类物质最适的pH值5.0～6.8范围[7，13]，生产中常采用添加柠檬酸的量使物料的pH值偏离最适范围，从而降低酶活。有研究表明，pH值低于3.0，或高于8.5时，多酚氧化酶的活性受到显著地抑制；在较强酸性条件下，多酚氧化酶的辅基Cu2+会解离出来；而在碱性条件下，辅基Cu2+会形成氢氧化铜沉淀，使酶失活[5]。而柠檬酸具有3个羧基，能够有效地降低体系中的pH值，且酸度适宜，是常用的酸度调节剂；此外柠檬酸可以螯合多酚氧化酶活性中心的Cu2+，从而降低酶活性[14]。试验结果表明，柠檬酸添加量越多，护色效果越好，但受制于口感，不宜超过0.50%。

引起褐变的3个必要条件是多酚类物质、多酚氧化酶和O2。从食品中去除多酚类物质不现实，因此只能够通过降低多酚氧化酶活性或者降低氧气含量来抑制酶促褐变发生。降低溶氧量主要是通过氮气保护[4]、添加1%～2%食盐[5]或者一定量蔗糖[6]等具有高渗透压的物料，来降低物料中的溶氧量，同样也可以使多酚氧化酶因脱水而失活。生产上常常采用高温热烫来达到灭酶效果，多酚氧化酶最适温度25～40 ℃，目前大部分加工工艺采用100 ℃水浴处理20～30 s来钝化多酚氧化酶活性[7]。

抗坏血酸或者D-异抗坏血酸钠主要作用一方面影响体系中pH值[15]，另一方面作为生物体中强还原剂能够将琨还原，甚至可以直接被多酚氧化酶氧化。但是过量添加抗坏血酸，在经过高温热烫之后，物料会呈现红色，这可能与抗坏血酸发生非酶褐变有关[16]。

在单因素试验基础上，选定合适的相关因素及其相应水平进行响应面分析试验，结果表明，香蕉最佳打浆护色工艺条件为柠檬酸添加量为0.50%，D-异抗坏血酸钠添加量为0.13%，水与果肉比保持0.085。