豆腐果苷抗血栓形成及减轻脑内炎症因子的作用

张维明 李立纪 陶 剑 陈得玲 唐世朗

1. 昆明学院医学院，云南 昆明 650214；2.昆明市医学科学研究所，云南 昆明 650041

豆腐果苷(Helicid，结构式如图1所示)为山龙眼科植物深绿山龙眼(HelicianilagiricaBedd)的干燥果实(豆腐渣果)的活性成分之一，豆腐渣果广泛分布于云南西南部和南部(西双版纳、普洱、保山、红河)等地，资源丰富，在云南西双版纳地区是独具民族特色和地区特色的傣医常用解毒药，可用于解农药和食物中毒[1]。目前对豆腐渣果的研究集中于其主要活性成分豆腐果苷，豆腐果苷是一种天然阿洛糖酚苷类化合物，其独特性在于结构中的糖基为稀有的吡喃阿洛糖，临床及药理活性研究[2]表明，豆腐果苷具有肯定的止痛、镇静和催眠作用，对神经衰弱综合征有较好的疗效，目前已开发出以之为主要成分的药物“神衰果素片”上市并销售，临床主要用于缓解神经官能症的头痛、头昏及睡眠障碍。豆腐果苷的结构与兰科植物天麻的活性成分天麻素相似，有研究[3]表明，豆腐果苷与天麻素在家兔体内具有相互作用，但相较于天麻素，对豆腐果苷活性的研究相当不足，其它药理作用研究非常少，形成了豆腐渣果及豆腐果苷主治单一的印象，严重影响了豆腐渣果的进一步开发和利用。对于豆腐渣果作为傣医常用解毒药的作用及机制则未见研究报道。

图1 化合物豆腐果苷的化学结构图

课题组前期在对豆腐渣果进行“解酒毒”的研究中发现，豆腐渣果提取物及活性成分豆腐果苷对小鼠酒精中毒性脑损伤模型具有保护作用，可减轻酒精中毒造成的脑内炎症(另文发表)。近年来的研究[4]发现，脑内过度的炎症反应是缺血性脑卒中患者继发性神经损伤、认知障碍的重要原因之一，抑制脑内炎症反应是缺血性脑卒中治疗的有效策略。为进一步探讨豆腐渣果活性成分豆腐果苷的药理活性，并验证豆腐果苷是否可减轻缺血性脑卒中后脑内炎症，故进行了本实验的研究，结果发现豆腐果苷具有较好的抗血栓形成及减轻脑内炎症的作用，现将研究结果报告如下。

1 实验材料

1.1 动物 健康SD大鼠，雄性，体重240～280 g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，合格证号：SCXK(川)2013-24；批号：0018160。

1.2 药物与材料 豆腐果苷，纯度99%，购自北京百灵威；花生四烯酸、地塞米松、吐温-80、水合氯醛(分析纯)购自天津市瑞金特化学品有限公司。大鼠肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor -α，TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β) 、ELISA 试剂盒(联科生物技术有限公司)；大鼠血栓烷B2(ThromboxaneB2，TXB2)、6-keto-PGF1α、半胱氨酰白三烯(Cysteinyl Leukotrienes，CysLTs)、白三烯B4(Leukotriene B4，LTB4 )ELISA 试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

2 实验方法

2.1 豆腐果苷对大鼠下腔静脉血栓形成的影响 将健康雄性SD大鼠随机分为4组：模型组(给予生理盐水)、阳性对照组(给予氯吡格雷，20 mg/kg 体重)、豆腐果苷高剂量组(给予50 mg/kg体重)、豆腐果苷低剂量组(给予10 mg/kg体重)，所有动物均连续灌胃给予相应受试物5 d，1次/d，末次给药后30 min，参考相关文献[5-6]方法，复制大鼠下腔静脉血栓模型，简述如下：所有大鼠以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，腹部正中切口，分离下腔静脉，用细丝线结扎，缝合腹腔，结扎4 h后，过量麻醉处死大鼠，打开腹腔，在结扎位置下方2 cm处用动脉夹夹闭下腔静脉管腔，将结扎段血管剪下，眼科剪剖开血管，取出血栓放于滤纸上，吸干血液，用微量电子天平称取血栓湿重。

2.2 豆腐果苷对花生四烯酸诱导大鼠脑血栓形成的影响 动物分组及给药同2.1，末次给药后30 min，参考相关文献[7]方法，复制花生四烯酸诱导大鼠脑血栓形成模型。简述如下：大鼠以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，分离右颈总动脉，结扎其颈外动脉分支和颈总动脉向心端，于远心端插入三通管，手术结束5 min后，经三通管向右颈总动脉以0.1 mL/100g体重注入0.5 mg/kg的花生四烯酸，5 min后从三通管内注入0.2%伊文思蓝0.5 mL/100 g体重，注射后5 min，过量麻醉处死动物，取出大脑，左右脑分别称取湿重，分别置匀浆器中，加入5 mL体积比为3∶7的0.5% Na2SO4及丙酮的混合液，制成脑匀浆液，密闭静置90 min，3000 rpm离心10 min，取上清液在620 nm处测吸光度，以栓塞侧脑半球吸光度与其脑组织重量的比值表示伊文思蓝的含量。

2.3 豆腐果苷对花生四烯酸诱导大鼠脑血栓模型脑内炎症因子的影响 将健康雄性SD大鼠50只，随机分为5组，分别为假手术组(给予生理盐水)、模型组(给予生理盐水)、阳性对照组(给予地塞米松，20 mg/kg 体重)、豆腐果苷高(50 mg/kg体重)、低剂量组(10 mg/kg体重)，所有动物均采用灌胃给药，各组动物连续给予相应受试物5 d，1次/d，末次给药后30 min，同2.2复制花生四烯酸诱导大鼠脑血栓模型，于右颈总动脉注入花生四烯酸3 h后，迅速处死动物，取出并分离右侧大脑，每100 mg脑组织加入1 mL PBS制成脑组织匀浆，将匀浆液4 ℃ 5000 rpm离心5 min，取上清液，ELISA试剂盒检测脑匀浆中TNF-α、IL-1β、TXA2、6-keto-PGF1α、CysLTs、LTB4的含量。

3 结果

3.1 豆腐果苷对大鼠静脉血栓形成的影响 豆腐果苷高、低剂量均能减轻大鼠下腔静脉血栓湿重，提示豆腐果苷具有显著的抑制大鼠下腔静脉血栓形成作用。见表1。

表1 豆腐果苷抗大鼠下腔静脉血栓形成的作用

3.2 豆腐果苷对花生四烯酸诱导大鼠脑血栓形成的影响 豆腐果苷高、低剂量均能明显减少大鼠栓塞侧脑组织中伊文思蓝含量，提示豆腐果苷可显著抑制花生四烯酸诱导的大鼠脑血栓形成，减轻由脑血栓形成造成的血脑屏障破坏。详见表2。

表2 豆腐果苷对花生四烯酸致大鼠脑血栓形成模型脑组织伊文思蓝含量的影响

3.3 豆腐果苷对花生四烯酸诱导大鼠脑血栓模型脑内炎症的影响 花生四烯酸注入大鼠脑内导致了大量炎症因子释放，给予高剂量豆腐果苷后明显降低了大鼠脑组织内炎症因子TNF-α、IL-1β的含量，说明豆腐果苷可减轻急性脑血栓形成后脑内的炎症；豆腐果苷对脑组织TXB2和6-keto-PGF1α含量无明显影响，但可降低CysLTs、LTB4的含量，提示豆腐果苷减轻脑内炎症的作用与抑制花生四烯酸代谢的5-脂氧合酶(5-Lipoxygenase，5-LOX)途径有关，而与其环氧合酶途径(Cyclooxygenase，COX)无关。详见表3、4、5。

表3 豆腐果苷对花生四烯酸致大鼠脑血栓模型脑组织TNF-α、IL-1β的影响

表4 豆腐果苷对花生四烯酸致大鼠脑血栓模型脑组织TXB2和6-keto-PGF1α的影响

表5 豆腐果苷对花生四烯酸致大鼠脑血栓模型脑组织CysLTs和LTB4的影响

4 讨论

2019年，由中国疾病预防控制中心与美国华盛顿大学合作完成的最新中国疾病负担结果报告中显示，自1990～2017年，中国居民疾病谱发生了重大的变化，年龄校正的中风死亡率下降了33.5%，但即使如此，中风仍然是中国人死亡的第一杀手[8]。缺血性脑卒中是临床卒中的主要类型，颈总动脉粥样硬化斑块脱落引起的血栓形成是导致缺血性脑卒中的重要原因之一。因此，抑制血栓形成是防治缺血性脑卒中的重要措施。

课题组前期的研究发现，豆腐果苷具有明显的体外抑制血栓形成的作用，结合血栓形成在缺血性疾病中的关键作用，为进一步阐明豆腐果苷潜在的抗血栓药理活性，实验采用了两种病理机制的血栓动物模型考察豆腐果苷体内抗血栓形成作用。对结扎大鼠下腔静脉导致血流瘀滞所形成的静脉血栓模型，豆腐果苷表现了显著的减轻血栓重量的作用，提示其具有抑制静脉血栓形成的作用，可能在抑制深静脉血栓形成中也具有一定的效果，值得进一步研究。花生四烯酸颈内动脉注射是诱导急性脑血栓形成的常用模型，大鼠颈内动脉注射花生四烯酸后，可迅速在脑内形成大量血栓，造成急性脑缺血损伤，同时可引起血脑屏障通透性的升高，此时给动物尾静脉注射生物染料伊文思蓝后，损伤侧脑组织中伊文思蓝渗入量可明显增加，提前给予豆腐果苷干预后，显著减少了大鼠脑组织中伊文思蓝的含量，提示其具有降低因脑内大量血栓形成而造成的血脑屏障通透性升高的作用，说明豆腐果苷对急性脑缺血损伤有较好的血脑屏障保护作用。大量研究已证实，缺血性脑卒中后脑内的炎症反应是造成血脑屏障破坏、脑内神经元继发性损伤的重要原因，抑制缺血性脑卒中后脑内炎症反应对改善中风的预后具有积极的作用。本实验的结果可知，大鼠颈内动脉注射花生四烯酸诱导血栓形成后，脑组织中炎症因子TNF-α、IL-1β显著升高，说明脑内出现明显的炎症反应，给予豆腐果苷后可降低模型动物脑组织中炎症因子TNF-α和IL-1β 的含量，提示豆腐果苷具有减轻急性脑缺血后脑内炎症反应的作用。花生四烯酸诱导的炎症反应具有两条经典途径，一为环氧合酶介导的炎症反应，其产物为前列腺素类，阿司匹林为该途径的选择性抑制剂。另一条为5-脂氧合酶介导的炎症反应，其产物为白三烯类，齐留通为该途径的选择性抑制剂。为探讨豆腐果苷减轻炎症是通过哪条途径而达到，故对两条途径下游的炎症介质进行了含量测定，结果显示，豆腐果苷可降低5-脂氧合酶介导白三烯类产物CysLTs和LTB4的含量，说明豆腐果苷可抑制由白三烯介导的炎症反应，LTB4是目前已知的体内最强的趋化因子，可趋化大量炎症细胞进入脑内，造成继发性的神经炎症损伤，豆腐果苷可降低LTB4的含量，这对于减少炎症细胞浸润，进而减轻继发性的神经炎症损伤具有积极的意义。花生四烯酸经环氧合酶途径代谢的产物是血栓素A2和前列腺环素，由于它们稳定性低，故本实验中测定了它们的稳定代谢产物TXB2和6-keto-PGF1α，结果显示豆腐果苷对它们的含量均无明显影响，提示其对花生四烯酸经环氧合酶代谢的途径没有明显影响，同时也说明豆腐果苷对花生四烯酸诱导的炎症反应具有选择性抑制作用，这与另一研究报道[9]的天麻活性成分对羟基苯甲醛的抗炎作用不同，羟基苯甲醛对花生四烯酸的环氧合酶途径炎症反应具有明显的作用，而对5-脂氧合酶途径作用不明显。提示在后续的研究中，有必要对豆腐果苷抗炎作用的构效关系进行深入研究。

综上所述，研究证实了傣药豆腐渣果的活性成分豆腐果苷抗血栓形成和抑制急性脑血栓动物模型脑内炎症的新活性，为拓展豆腐果苷及神衰果素片的临床新用途提供了科学依据，但其深入的作用机制有待进一步研究。