乌三金洗剂质量标准研究

李德林 张子侠

安徽省太和县中医院，安徽 太和 236600

带下病是目前临床发病率较高且难以治愈的妇科疾病之一，西医中的阴道炎、宫颈炎、盆腔炎性等疾病均属于此范畴，该病具有慢性缠绵且易复发的特点，给广大女性身心健康带来了很大的困扰[1]。因此，寻找有效、持久、低毒的治疗女性带下病药物十分必要。现代基础及临床研究[2]表明，中医药在治疗女性带下病上不仅疗效显著，且作用持久不易复发，适合长期使用。乌三金洗剂由乌梅、土荆皮、黄柏、大黄及苦参等十味中药组成，功能除湿祛毒、杀虫止痒。处方遵照中医理论，结合多年临床经验，提出“虫邪外感、湿热蕴结”，是从“湿”“毒”“虫”着手来研究揭示“带下病”的一般病机规律，采取辨病与辩证的方法，针对湿毒蕴肤型皮肤黏膜疾病所拟定的方剂。本制剂在我院已应用多年，临床效果较好，然而尚缺乏有效的质量控制方法，为了更好的保证制剂质量及临床用药的安全性和有效性，本研究采用TLC法对乌三金洗剂中黄柏、苦参、大黄、蛇床子及土荆皮进行定性鉴别研究，并采用HPLC法对乌三金洗剂中蛇床子素含量进行测定。

1 仪器与材料

1.1 仪器 XSE105DU型十万分之一电子天平(梅特勒-托利多)；Ultimate 3000型高效液相色谱仪(赛默飞)；PHS-2F型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；ZF-2型三用紫外仪(上海市安亭电子仪器厂)；DHG-9055A型电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；HH-S4型数显恒温水浴锅(常州国宇仪器制造有限公司)；KQ-300DE型数控超声波清洗器(上海杰理科技有限公司)。

1.2 试药 大黄对照药材(批号：120984-201202)、盐酸小檗碱(批号：110713-201613)、蛇床子素(批号：110822-201609)、苦参碱(批号：110805-200508)、土荆皮乙酸对照品(批号：110880-201604)等均购自中国食品药品检定研究院。乌三金洗剂(规格：每瓶250 mL，本院中药制剂室自制，批号：20170824，20170825，20170826)。蛇床子、黄柏、乌梅、大黄等十味中药均购自于安徽守正中药饮片有限公司，并经本院马德强主任中药师鉴定，均符合2015年版《中国药典》一部及2019年版《安徽省中药饮片炮制规范》要求；乙腈为色谱纯，水为纯化水，甲醇、乙醚、乙酸乙酯等其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

2.1.1 黄柏 取乌三金洗剂10 mL，加甲醇10 mL超声处理20 min，离心，取上清液作为供试品溶液[3-4]；另取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液；再按乌三金洗剂制备工艺生产不含黄柏的样品，同法制得缺黄柏阴性对照溶液。照TLC法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述三种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G板上，以正丁醇-冰醋酸-水(6∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。结果供试品溶液色谱中，在与盐酸小檗碱对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，斑点清晰可见，分离效果较好，阴性无干扰，专属性较好，三批乌三金洗剂均检出黄柏。结果如图1所示。

1.盐酸小檗碱对照品溶液;2～4.供试品溶液；5.阴性样品图1 黄柏TLC鉴别图

2.1.2 苦参 取乌三金洗剂10 mL，滴加浓氨水将溶液pH调至10～11，氯仿振摇提取3次，每次 15 mL，合并提取液，水浴蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，即得供试品溶液[5-6]；另取苦参碱对照品适量，加甲醇制成每1毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液；再按乌三金洗剂制备工艺生产不含苦参的样品，同法制得缺苦参阴性样品溶液。照TLC法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述三种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G板上，以环己烷-丙酮-乙酸乙酯-浓氨试液(2∶3∶4∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液并吹干。结果供试品溶液色谱中，在与苦参碱对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的橘红色斑点，斑点清晰可见，分离效果较好，且阴性对照无干扰，专属性较好，三批乌三金洗剂均检出苦参。结果如图2所示。

1.苦参碱对照品溶液；2～4.供试品溶液；5.阴性样品图2 苦参TLC鉴别图

2.1.3 大黄 取乌三金洗剂10 mL，加盐酸 1 mL，加热回流30 min，立即冷水冷却至室温，以无水乙醚提取2次，每次20 mL，合并提取液，蒸干，残渣加氯仿1 mL使溶解，即得供试品溶液[7-8]；另取大黄对照药材0.1 g，加甲醇20 mL，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，余下同供试品溶液制备方法，作为对照药材溶液；再按乌三金洗剂制备工艺生产不含大黄的样品，同法制得缺大黄阴性对照溶液。照TLC法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述三种溶液各 5 μL，分别点于同一硅胶G板上，以甲酸乙酯-石油醚(30～60 ℃)-甲酸(5∶15∶1)上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。结果供试品溶液色谱中，在与大黄对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，置氨蒸气熏后，斑点变为红色，清晰可见，且阴性样品无干扰，专属性较好，三批乌三金洗剂均检出大黄。结果如图3所示。

1.大黄对照药材溶液;2～4.供试品溶液;5.阴性样品

1.大黄对照药材溶液;2～4.供试品溶液;5.阴性样品图3 大黄TLC鉴别图

2.1.4 蛇床子 取乌三金洗剂20 mL，用无水乙醚振摇萃取2次，每次30 mL，乙醚层合并，加入10 mL碳酸氢钠饱和溶液振摇提取，乙醚层蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，即得供试品溶液[9-10]；另取蛇床子素对照品适量，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液；再按乌三金洗剂制备工艺生产不含蛇床子的样品，同法制得缺蛇床子阴性对照溶液。照TLC法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品及阴性对照溶液各10 μL，对照品溶液5 μL，以正己烷-乙酸乙酯(17∶4)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，斑点清晰可见，分离效果较好，且阴性对照无干扰，专属性较好，三批乌三金洗剂均检出蛇床子。结果如图4所示。

1.蛇床子素对照品溶液；2～4.供试品溶液；5.阴性样品图4 蛇床子TLC鉴别图

2.1.5 土荆皮 取乌三金洗剂30 mL，浓缩至稠，加硅胶(100-200目)5 g拌匀，干燥至干，研匀，加乙醚30 mL超声30 min，滤过，取滤液，用5%碳酸氢钠溶液30 mL提取，取碳酸氢钠溶液，滴加稀盐酸调pH为1～2，以乙醚30 mL提取，乙醚提取液用水10 mL洗涤，取乙醚层，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，即得供试品溶液[11]；另取土荆皮乙酸对照品适量，加甲醇制成每1毫升含1 mg的对照品溶液。再按乌三金洗剂制备工艺生产不含土荆皮的样品，同法制得缺土荆皮阴性对照溶液。照TLC法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品及阴性对照溶液各10 μL，对照品溶液5 μL，以石油醚(30-60 ℃)-三氯甲烷-冰醋酸(6∶10∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以4%香草醛乙醇溶液-20%硫酸溶液(1∶1，临用前混合)的混合溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。结果供试品溶液色谱中，在与土荆皮乙酸对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，斑点清晰可见，分离效果较好，且阴性对照无干扰，专属性较好，三批乌三金洗剂均检出土荆皮。结果如图5所示。

1.土荆皮乙酸对照品溶液；2～4.供试品溶液; 5.阴性样品图5 土荆皮TLC鉴别图

2.2 蛇床子素HPLC含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：岛津Wonda Cract ODS2柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(70∶30)；流速：1.0 mL/min；柱温设置为30 ℃；检测波长为322 nm；理论塔板数按蛇床子素峰计应不得低于3000，进样量为10 μL。

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 对照品溶液的制备 取蛇床子素对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1毫升含12.63 μg的蛇床子素对照品溶液，摇匀，即得。

2.2.2.2 供试品溶液的制备 精密吸取本品 25 mL，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次25 mL，合并乙酸乙酯提取液，乙酸乙酯提取液置水浴上蒸干，残渣加乙醇适量溶解，转移至25 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得[12-13]。

2.2.2.3 阴性对照溶液的制备 按乌三金洗剂处方和制备工艺制备缺蛇床子的阴性样品，再按“2.2.2.2”项下方法制备缺蛇床子阴性对照溶液。

2.2.3 专属性试验 按“2.2.1”项下色谱条件，分别吸取上述供试品溶液、蛇床子素对照品溶液和阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪中，记录各自色谱图。结果供试品色谱中，在与对照品色谱相同的保留时间内出现蛇床子素色谱峰，且蛇床子素分离度及拖尾因子均符合要求，而阴性对照无干扰，故该法专属性良好。结果如图6所示。

A.蛇床子素对照品；B.供试品；C.阴性样品；1.蛇床子素色谱峰图6 蛇床子素HPLC图

2.2.4 线性关系考察 取“2.2.2.1”项下的蛇床子素对照品溶液适量，置自动进样器中，分别吸取1、2、5、10、15、20 μL于液相色谱仪中，再按上述“2.2.1”项下色谱条件进样，并记录峰面积。并以蛇床子素对照品进样量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归。结果得蛇床子素的回归方程为：Y= 0.0606X- 0.0062(r=0.9999)，以上结果表明蛇床子素在进样量为12.63 ～ 252.60 μg范围内呈现良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 取“2.2.2.1”项下蛇床子素对照品溶液适量，置自动进样器中，按“2.2.1”下的色谱条件，连续进样6次，测定蛇床子素峰面积。结果蛇床子素平均峰面积为6.539，RSD为0.26%(n=6)，说明该仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 精密吸取乌三金洗剂(批号：20170824)25 mL，按“2.2.2.2”下制备方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件，将供试品溶液置于自动进样器中，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，并记录蛇床子素峰面积，结果蛇床子素平均峰面积为7.814。RSD为0.11%(n=6)，表明乌三金洗剂供试品溶液在室温放置24 h内较为稳定。

2.2.7 重复性试验 精密量取同一批次的乌三金洗剂6份(批号：20170824)，每份25 mL，按上述“2.2.2.2”项下供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，置于自动进样器中，再按上述“2.2.1”项下色谱条件进样，测定蛇床子素峰面积。结果蛇床子素平均峰面积为7.762，RSD为0.56%(n=6)。表明该方法重复性较好。

2.2.8 加样回收率试验 精密量取已知含量的乌三金洗剂6份(批号：20170824)，每份12.5 mL，分别精密加入蛇床子素对照品适量，按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，置于自动进样器中，再按上述“2.2.2.1”项下色谱条件，测定蛇床子素峰面积并计算其蛇床子素加样回收率。结果6份样品的平均回收率为96.45%，RSD为0.93%(n=6)。表明样品回收率良好，该法准确度较高。

2.2.9 样品含量测定及含量限度的确定 通过投料前对蛇床子药材中蛇床子素含量测定，以及生产的成品中蛇床子素的含量比较，计算得到该工艺蛇床子素的转移率。结果表明，蛇床子饮片中蛇床子素含量为2.94 %，根据处方换算，乌三金洗剂中蛇床子素的理论含量为1.0584 mg/mL，即制成制剂后每毫升含蛇床子素为1.0584 mg。实际生产中，批号为20170824、20170825、20170826三批样品中蛇床子素的含量分别为12.84 μg/mL、12.67 μg/mL、12.65 μg/mL，转移率分别为1.21%、1.20%、1.19%，平均转移率为1.20%。根据中国药典2015年版一部规定：蛇床子饮片中蛇床子素的含量不得少于1.0%，因此，制成制剂后含量限度确定为：每毫升含蛇床子以蛇床子素(C15H16O3)计，不得少于4.32 μg，三批样品所测得含量，每毫升含蛇床子素均高于4.32 μg。结果见表1。

表1 含量限度考察结果

3 讨论

3.1 薄层鉴别 黄柏薄层鉴别时，参考相关文献[14-15]，同苦参处理方法，将样品碱化后用氯仿提取，结果显示样品主斑点虽较为清晰，但阴性样品在与对照品溶液色谱处有微弱干扰，考虑到此法在提取亲脂性生物碱的同时，也带来亲脂性杂质，遂改用醇类溶剂提取法，采用甲醇直接超声，结果斑点清晰，阴性无干扰，且该法更为简单。苦参薄层鉴别时，以丙酮-甲苯-甲醇(3 ∶8∶0.5)为展开剂，再以乙酸乙酯-甲苯-甲醇-水(4∶2∶2∶1)上层溶液为展开剂，结果斑点虽较为清晰，阴性无干扰，但操作较为复杂，且甲苯对环境及人体的健康危害较大，故改用乙酸乙酯-环己烷-丙酮-浓氨试液(4∶2∶3∶0.2)为展开剂，效果较为理想。此外，本研究还对方中乌梅、百部、地肤子及花椒等药味进行了薄层鉴别研究，结果发现百部及地肤子阴性对照有干扰，花椒及乌梅因主要含有挥发性成分，本制剂在传统水提工艺下，尚不能对两者挥发性成分充分提取，故与对照药材相比，主斑点较不清晰，暂未纳入乌三金洗剂质量标准。

3.2 提取方法的优化 因蛇床子在方中作为君药，蛇床子素作为蛇床子药材中含量最高且主要药理活性成分，有研究[16]报道其具有较好的止痒、抗菌及增强免疫功能等作用，可治疗阴道炎及外阴湿疹等妇科疾病，与乌三金洗剂的主要功效尤为相似，故本研究拟将其作为乌三金洗剂HPLC测定的指标性成分。蛇床子素属于香豆素类化合物，文献报道[17-18]，蛇床子及其制剂中蛇床子素中的提取方法有乙酸乙酯萃取、乙醚萃取及甲醇超声提取等。研究前期曾对以上方法进行了比较，结果发现以乙酸乙酯萃取提取率较高，并对萃取次数进行了考察，结果显示乙酸乙酯萃取4次蛇床子素含量较萃取3次高，而与萃取5次相差不大，说明萃取4次可提取完全，故本研究以乙酸乙酯萃取4次作为蛇床子素的最佳提取方法。

3.3 流动相和色谱柱的考察 乌三金洗剂为中药复方制剂，方中干扰成分较多，流动相的优化和色谱柱的选择对样品的分离有着重要的影响。研究曾参考相关文献对甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液及乙腈-水进行了考察。结果发现有机相为乙腈时，理论塔板数较甲醇高，且出峰时间较短，无机相为水或磷酸水溶液对峰形影响不大。此外，研究又对不同品牌的色谱柱(Thermo Syncronis C18、Hypersil ODS2及Wonda Cract ODS2)进行比较，结果发现Thermo Syncronis C18柱上蛇床子素分离度较差，Wonda Cract ODS2较Hypersil ODS2出峰时间短且分离效果较好。故本研究选择以乙腈-水溶液和Wonda Cract ODS2柱作为最佳流动相和色谱柱。

综上所述，研究建立的黄柏、苦参、大黄、蛇床子及土荆皮的TLC阴性对照无干扰、斑点清晰且专属性较强。蛇床子素的HPLC含量测定方法简便易行，重现性较好，为控制和评价乌三金洗剂的质量提供科学依据。然而由于受条件限制，本实验仅涉及单一成分的含量测定，还不能从整体上完全反映乌三金洗剂的内在质量，故下一步本研究拟采用指纹图谱技术对该制剂进行深层次的探究，以建立起更完整的质量控制标准。