miR-25-3p表达水平与急慢性肝衰竭预后的关系探讨

黄明，彭彬，辛大平，房仲平

(广安市人民医院 肝胆外科，四川 广安 638001)

急慢性肝衰竭在慢性肝病患者中较常见，临床症状包括腹水、凝血障碍、黄疸等，在肝衰竭中占比高达60%，我国慢性乙肝(chronic hepatitis B，CHB)患病率较高，导致与之相关的急慢性肝衰竭发生率也较高[1-2]。目前，由于肝衰竭缺乏特效药物进行干预，主要通过积极对症处理控制病情，尽早诊疗是预防并发症、降低死亡率的关键，早期诊疗对疾病转归而言至关重要。既往临床通过症状表现、肝功能检查等对急慢性肝衰竭进行辅助评估，虽然有一定价值，但对预后评价的效果欠佳[3]。近年来，研究发现微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)对可编码蛋白基因有调控作用，能通过与某些编码基因结合，在肝病中发挥作用[4]。有学者指出微小核糖核酸-25-3p(miR-25-3p)表达可能与机体重要脏器功能(如肝、肺、心等)受损有关，但具体机制不详[5]。考虑到慢性肝衰竭患者伴有明显的肝损害，本研究拟分析miR-25-3p表达水平与急慢性肝衰竭预后的关系，寻求与该病相关的新预测标志物以及干预靶点，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入我院2018年9月至2020年9月收治的急慢性肝衰竭患者84例作为肝衰竭组，选取同期收治的CHB患者77例作为CHB组，选取同期于我院体检的健康志愿者60例作为对照组。研究方案经伦理委员会批准，3组基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 3组基线资料的比较

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 (1)肝衰竭组：满足《肝衰竭诊治指南(2018年版)》[6]中的相关诊断标准者；年龄≥18岁者；就诊时行肝功能检查、血清miR-25-3p检测者；对研究内容知情同意者。(2)CHB组：满足《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[7]中关于CHB诊断标准者；未见CHB相关的并发症者；年龄≥18岁者；乙型肝炎表面抗原阳性持续时间超过6个月者；能配合完成相关检查者；知情同意者。(3)对照组：同期体检的健康志愿者，肝功能正常；年龄≥18岁者；可配合检查者；签署同意书者。

1.2.2 排除标准 因酒精、药物所致肝损伤者；患有恶性肿瘤者；患脂肪肝、自身免疫性肝炎者；心、脑等脏器功能不全者；入院前1个月内有抗病毒治疗史者。

1.3 方法

3组受试者均采集5 ml空腹肘静脉血，分装于两管，一管用于检测肝功能指标，另一管用于检测乙肝病毒基因(Hepatitis B virus-DNA，HBV-DNA)及miR-25-3p。采血后离心10 min，转速3 000 r·min-1，离心半径8cm，分离血清，存放于-70 ℃待测。

1.3.1 肝功能指标检测 采用海力孚HF-240全自动生化分析仪检测血清总胆红素(total bilirubin，TBIL)、白蛋白(albumin，ALB)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)水平，吸取约20 μl血样上机检测。

1.3.2 HBV-DNA检测 采用荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)法检测，仪器为杭州博日科技FQD-48A PCR检测仪，HBV-DNA试剂由东北制药集团股份有限公司提供，利用浓缩裂解法对HBV-DNA进行提取，扩增条件为93 ℃预变性2 min，93 ℃变性5 s，57 ℃退火、延伸45 s，40个循环，待反应完毕经电脑软件分析定量结果。

1.3.3 血清miR-25-3p检测 采用实时逆转录PCR(quantitative real-time reverse transcription PCR，qRT-PCR)法检测，主要试剂为氯仿、异丙醇、蒸馏水，由Invitrogen公司配制，Trizol及miRNA试剂购自赛默飞世尔科技公司。主要仪器为TGL-16M型离心机(山东博科生物有限公司)、FQD-48A型PCR检测仪(杭州博日科技有限公司)、F3系列微量移液器(赛默飞世尔科技公司)。具体方法如下：(1)提取与检测总RNA。将存放于低温环境内的血清取出，在室温下复温，取血清400 μl置于EP管内，取Total RNA 提取试剂1 ml加入，经移液枪吹打，在常温下反应25 min；在4 ℃下离心10 min(12 000 r·min-1)；留取上清液放置于新EP管内，取氯仿200 μl加入，封盖，振荡混匀，室温下反应15 min；在4 ℃下离心10 min(12 000 r·min-1)，此时样本出现3层，分别为水样层(上层)、中间层以及苯酚-氯仿层(下层)，RNA在上层水样中；取异丙醇500 μl加入新EP管内，将上层水样加入，在4 ℃下反应10 min，离心处理20 min(12 000 r·min-1)；将上清液移去，取75%乙醇1 ml加入，混合充分，在4 ℃下离心20 min(700 r·min-1)；将上清液去除，在室温下静置15 min，取去离子水25 μl加入，使RNA溶解；取总RNA 2 μl，测定RNA浓度、纯度，如果A260/A280在1.8～2.0之间，则提示纯度合格。(2)针对总RNA行逆转录，合成cDNA液，待反应完毕取出cDNA产物，迅速将其冷却，行PCR检测。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min；92 ℃变性2 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，50个循环。引物序列如下：miR-25-3p上、下游序列分别为5′-CATTGCACTTGTCTCGGTCTGA-3′、5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′；以U6为内参引物，上、下游序列分别为5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′、5′-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′。待循环结束观察溶解曲线的变化，检测温度、升温速度以及恒温时间分别为70～95 ℃、0.5 ℃·次-1、5 s·次-1，以2-ΔΔCT表示miR-25-3p表达水平。

1.3.4 随访分析 从患者住院开始观察，直至观察3个月结束，对出院的患者通过微信、电话进行随访，记录预后情况，并将生存者纳入生存组，死亡者纳入死亡组，本次无失访病例。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计数资料用百分比(%)表示，行χ2检验；计量资料以均数±标准差表示，3组间比较采用方差分析，两两比较行独立样本t检验。急慢性肝衰竭患者血清miR-25-3p水平与肝功能指标及HBV-DNA的相关性采用Pearson线性相关分析，采用Cox多元回归模型分析预后危险因素，绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic curve，ROC)曲线分析miR-25-3p评估预后的曲线下面积(area under the curve，AUC)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组血清miR- 25- 3p、肝功能指标及HBV- DNA的比较

肝衰竭组、CHB组的血清TBIL、AST、ALT水平高于对照组，血清miR-25-3p、ALB水平低于对照组；肝衰竭组血清miR-25-3p表达水平低于CHB组，血清TBIL、AST、ALT水平高于CHB组，差异均有统计学意义(P<0.05)；肝衰竭组与CHB组HBV-DNA比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 3组血清miR-25-3p、肝功能指标及HBV-DNA比较 例

2.2 肝衰竭组患者血清miR- 25- 3p与肝功能指标、HBV- DNA的相关性

Pearson线性相关分析显示，血清miR-25-3p与TBIL、AST、ALT呈负相关(分别为r=-0.524、P=0.007，r=-0.768、P<0.001，r=-0.741、P<0.001)，与ALB、HBV-DNA无相关性(分别为r=0.274、P=0.059，r=0.196、P=0.078)。

2.3 肝衰竭组不同预后患者血清miR- 25- 3p、肝功能指标、HBV- DNA比较

在84例急慢性肝衰竭患者中，3个月内生存55例(65.48%)，死亡29例(34.52%)。死亡组血清miR-25-3p表达水平低于生存组，血清TBIL、AST、ALT水平高于生存组，差异均有统计学意义(P<0.05)，两组ALB、HBV-DNA水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 肝衰竭组不同预后患者血清miR-25-3p、肝功能指标、HBV-DNA比较

2.4 肝衰竭组患者预后的单因素及Cox多因素回归分析

单因素分析显示生存组与死亡组间ALB、HBV-DNA表达无差异，故此处将这两项变量排除。以miR-25-3p、TBIL、AST、ALT均值为界赋值，以预后为因变量Y(生存=0，死亡=1)，Cox多因素回归分析显示，血清miR-25-3p水平增高是预后的保护性因素，而血清TBIL、AST、ALT水平增高是预后的危险因素(P<0.05)，见表4。

表4 肝衰竭组患者预后的单因素及Cox多因素回归分析

2.5 血清miR- 25- 3p评估急慢性肝衰竭预后的价值分析

ROC曲线显示，血清miR-25-3p评估急慢性肝衰竭预后的AUC为0.768(标准误0.058，P<0.001，95%CI0.654～0.883)，最佳界值为58.676，敏感度为88.20%，特异度为69.70%，见图1。

图1 血清miR-25-3p评估急慢性肝衰竭预后的ROC曲线

3 讨 论

急慢性肝衰竭病情进展非常快，因受病程、发病诱因等因素影响，患者存在较大个体差异，随着病程延长，可能引起肝性脑病、凝血功能障碍等并发症，总体预后不理想[8]。研究表明miRNA在肝病中发挥了重要作用，它经转录后能对基因表达进行调控，与细胞凋亡、分化、增殖以及炎症反应密切相关，在血清内存在稳定表达[9]。寻求可靠的miRNA指标，可能对急慢性肝衰竭评估有一定价值，从而发现新治疗靶点。研究发现miR-25具有抗氧化损伤作用，能减少细胞凋亡，对机体脏器有保护作用，而一旦其表达异常，则会促进脏器损伤，例如心、肝、肺等均可能出现损害[10]。miR-25-3p是miR-25的3′端臂加工而产生的一种miRNA，现阶段与之相关的研究较少，尚未完全明确其与肝衰竭之间的关系。本研究分析miR-25-3p在肝衰竭中的作用机制，观察其与患者预后之间的关系，为临床诊疗提供思路。

本研究结果显示，急慢性肝衰竭患者的血清miR-25-3p水平较CHB患者、健康体检者明显降低。既往关于miR-25-3p的报道较少，且主要集中于肿瘤领域，例如薛亚军等[11]发现miR-25-3p能通过调节肿瘤细胞增殖参与食管鳞癌转移过程，程燕等[12]研究显示miR-25-3p对甲状腺乳头癌的诊断有一定价值。miR-25-3p的生物功能比较复杂，研究表明miR-25-3p表达对机体免疫系统有调节作用，其表达下调可能与免疫系统受损有关，提示机体存在免疫功能障碍[13]。另有学者发现miR-25-3p对炎症反应有抑制作用，可通过下调炎症介质表达减轻机体炎症[14]。这表明miR-25-3p可能通过调节免疫、炎症反应的机制保护机体功能。本研究显示急慢性肝衰竭患者的血清miR-25-3p下调，这可能与免疫功能障碍有关。已有研究[15]证实免疫紊乱参与了肝衰竭进展，因患者出现肝脏损害，继而可导致循环系统、肠道免疫监视等功能受损，削弱机体免疫，患者可能因免疫系统受损导致miR-25-3p表达下调。

本研究结果显示急慢性肝衰竭患者血清TBIL、AST、ALT水平在3组中最高，表明患者出现明显肝损害，与既往结论[16]基本吻合。肝衰竭的直接表现为肝功能恶化，涉及的机制比较复杂，主要与肝内炎症、免疫紊乱、中性粒细胞失调等有关，可导致肝脏的解毒、转运功能下降，促进肝损害[17]。此外，本研究显示肝衰竭组的血清ALB下降，这对肝功能也有较大影响。ALB在血浆中存在表达，它是机体所需的一种重要蛋白质，在肝脏解毒与运转中同样发挥了重要作用，一旦ALB水平下降，则可致白蛋白功能、结构改变，削弱肝脏的解毒与转运能力[18]。本研究显示肝衰竭患者的血清miR-25-3p与TBIL、AST、ALT水平有相关性。miR-25-3p在肝衰竭中可能对机体功能有保护作用，在免疫功能障碍的情况下呈低表达，而肝衰竭患者机体处于免疫紊乱状态，致血清miR-25-3p表达下调，免疫功能削弱不利于肝功能恢复，甚至可进一步加重肝损害。罗杰等[19]研究提示乙型肝炎病毒相关慢加急性肝衰竭患者的miR-25-3p表达下调超过2倍，其评估该病的曲线下面积高于0.800，表明miR-25-3p表达在肝衰竭中评估价值较高。miR-25-3p参与肝损伤的机制比较复杂，可能通过调节内源性Notch1信号通路或Wnt、Notch信号通路，在肝脏疾病中发挥作用[20]。本研究还提示血清miR-25-3p表达增高对急慢性肝衰竭预后有保护作用，且对预后有一定评估价值。miR-25-3p表达增高可能意味着患者的机体免疫状态较好，能对脏器功能起到保护作用，为脏器恢复提供良好的内环境，对改善预后有益。蔡莉等[21]以糖尿病肾病小鼠进行研究发现，miR-25-3p能通过抑制机体炎症保护小鼠的肾功能，这也提示miR-25-3p可在机体功能中发挥正向调控作用。目前，临床针对miR-25-3p与肝病关系的研究较少见，本研究也尚处于初步探索阶段，未来还需对此进行更深入探讨。

miR-25-3p在急慢性肝衰竭患者血清中呈低表达，且与患者预后密切相关，其表达增高可能对预后有保护作用，临床有望通过测定血清miR-25-3p水平对其预后进行预测。本研究局限性为样本数据偏少，且尚未考虑地域、年龄等因素对miR-25-3p表达的影响，日后还须综合考虑多种因素，进一步分析miR-25-3p的作用机制。