基于网络药理学探讨温肾宣痹方治疗膝骨关节炎的作用机制

丁亮，茆军，梅伟，王培民 ，黄利佳，廖太阳

(1.南京中医药大学附属医院/江苏省中医院 骨伤科，江苏 南京 210029；2.南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210029)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是骨科常见病之一，它的主要病理特点为关节软骨破坏、软骨下骨硬化或囊性变、关节边缘骨质增生、滑膜病变、关节囊挛缩、韧带松弛或挛缩、肌肉萎软无力等[1]。流行病学调查研究显示，我国症状性KOA(诊断明确，存在膝关节疼痛等症状且需要就诊)的患病率为8.1%，随着我国人口老龄化程度加剧，该比例还会持续上升[2]。现代医学多采取分级治疗方式治疗KOA，可根据患病程度分别采取基础治疗(患者教育、运动治疗、物理治疗、行动支持治疗等)、药物治疗(口服镇痛药，关节腔药物注射、口服中成药等)、修复性治疗(关节镜手术、软骨修复手术、力线矫正手术等)和重建性治疗(单髁置换术、全膝关节置换术等)等方式治疗，但都存在一定的局限性，包括药物副作用、手术副作用、假体使用年限等[3]。中医将KOA归为“痹证”“骨痹”“筋痹”等范畴，现统称为“膝痹”，证属本虚标实、本痿标痹。主要病因病机为肝肾不足、风寒湿邪侵袭机体，导致膝部筋络气血不通，故而为痛为肿。温肾宣痹汤是王培民教授由多年临床经验总结而来，该方以温补肾阳、祛风除湿之药为主，补气强骨、利水渗湿、行气活血止痛之药为辅，强筋健骨同时用以利水药疏利关节，补泻并进，滋而不腻，诸药合用共奏温补肾阳、祛风除痹之功[4]。尽管该方临床取得了一定疗效，然而具体作用机制尚待研究，本研究旨在通过网络药理学的方法，就温肾宣痹汤治疗KOA的潜在作用机制加以探讨，为基础研究提供思路。

1 资料与方法

1.1 数据库及软件

本研究使用的数据库及软件如下：中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，人类基因数据库(The Human Gene Database，GeneCards)，人类基因及遗传疾病在线目录(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)，DAVID生物信息学资源数据库，蛋白互作与功能富集分析平台(STRING)，Cytoscape软件，R语言软件，Perl软件。见表1。

表1 相关数据库及软件

1.2 温肾宣痹汤有效成分库及靶基因库

登录TCMSP数据库，分别以附子、桂枝、牛膝、独活、桑寄生、薏苡仁、白术、秦艽、黄芪、威灵仙、炙甘草为关键词，检索目前已知的每味中药所含的有效成分，并进行初步筛选，条件为：口服生物利用度(OB)>30%，生物类药性(DL)>0.18；构建温肾宣痹汤的有效成分库，同时通过TCMSP数据库查询以上重要的有效成分的作用靶点，并通过Perl软件构建靶基因库。

1.3 KOA靶基因库构建

以knee osteoarthritis为关键词，分别检索GeneCards及OMIN数据库，合并所查得的有关KOA相关的靶点，筛选并构建KOA相关靶基因库。

1.4 交集基因库构建

使用R语言软件及Perl软件，取得温肾宣痹汤与KOA靶点基因的交集基因，并绘制Veen图，得到温肾宣痹汤-KOA共同靶点基因。

1.5 PPI网络构建及核心靶基因筛选

将通过上述步骤得到的温肾宣痹汤-KOA共同靶点基因输入STRING数据库，选择Multiple Proteins Search，限定物种为Homo sapiens，保存下载TSV格式的分析结果，绘制蛋白相互作用网络图，并通过R语言计算每个靶点基因的度值(即靶点基因之间的相互连接数目)，取大于平均度值的靶基因为核心靶基因。

1.6 药物成分-靶基因-疾病调控网络的构建

利用Cytoscape软件对STRING网站得到的结果与温肾宣痹汤有效成分以及共同靶点基因进行分析，构建药物成分-靶基因-疾病调控网络，并对网络图中节点大小及颜色进行调整。

1.7 GO基因本体论与KEGG富集分析

将所得到的温肾宣痹汤-KOA共同靶标基因输入DAVID数据库中进行分析计算，得出GO功能富集分析与KEGG富集分析的结果。

2 结 果

2.1 温肾宣痹汤有效成分库及靶基因库

通过TCMSP数据库，分别以附子、桂枝、牛膝、独活、桑寄生、薏苡仁、白术、秦艽、黄芪、威灵仙、炙甘草为检索词，设置OB和DL参数，筛选后共得到196个有效成分，对应靶点222个。见表2(仅部分显示)。

表2 筛选后温肾宣痹汤有效成分及其OB、DL

2.2 KOA相关基因库

以knee osteoarthritis为检索词，分别检索GeneCards数据库以及OMIM数据库，共得到KOA相关靶点基因2 064个。

2.3 温肾宣痹汤-KOA交集基因库

将上述检索得到的222个中药靶点基因与KOA相关靶点基因取交集，得到温肾宣痹汤-膝骨性关节炎共同靶点基因116个，并使用R语言软件绘制Veen图。见图1。

图1 温肾宣痹方与KOA靶点基因交集Venn图

2.4 PPI网路构建及核心靶点基因筛选

将上述得到的116个中药-疾病共同靶点输入“STRING”数据库，设置相关条件后运行得到靶基因蛋白互作网络图，见图2。同时以大于平均度值为条件，筛选得到57个核心靶点基因，见图3。

图2 温肾宣痹方治疗KOA靶基因蛋白互作网络图

图3 蛋白互作核心靶点条图

2.5 药物成分-靶基因-疾病调控网络

通过Cytoscape软件整合分析中药复方温肾宣痹汤的核心有效成分以及对应的药物作用靶标基因与股骨头坏死疾病共同基因之间的关系，构成温肾宣痹汤-靶基因-KOA疾病调控网络。见图4。

图4 温肾宣痹方-药物成分-靶基因-疾病调控网络图

2.6 GO基因本体论与KEGG富集分析

对核心靶基因进行GO本体论分析，得出温肾宣痹汤治疗KOA的核心分子功能主要涉及细胞因子活性、DNA结合转录因子结合、核激素受体结合、雌激素受体结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、细胞因子受体结合、激素受体结合、核受体结合、生长因子受体结合等。见图5、6。

图6 GO基因本体论分析柱状图

KEGG富集分析显示，共筛选出温肾宣94条温肾宣痹汤治疗膝骨性关节炎的潜在通路。主要涉及AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等，见图7、8。

图7 KEGG富集分析气泡图

3 讨 论

温肾宣痹汤是王培民教授在多年临床实践中探索而来的，该方由附子、桂枝、牛膝、独活、桑寄生、薏苡仁、白术、秦艽、黄芪、威灵仙、炙甘草等组成。重用附子以温肾扶阳、散寒止痛；桂枝辛温，温表阳以固卫气，又祛风湿；白术健脾利湿化水，通经络，配以薏苡仁增强其健脾利湿化水之功，缓解寒饮造成的疼痛；独活辛苦微温，祛伏邪之风，除蕴久之痹；秦艽、威灵仙共奏祛风除湿、舒筋活络、通利关节之效，桑寄生、牛膝补益肝肾而强壮筋骨，辅以甘草，调和诸药，辅以补益中焦，助扶正祛邪之用。

通过筛选我们共得到该方的有效成分196个，通过检索得到其对应靶点222个，通过与KOA疾病靶点取交集后得到了57个核心靶点，其中评分前3名的靶点基因依次为IL-16、蛋白激酶B(PKB/AKT1)、血管内皮生长因子-A(VEGFA)。IL-6是一种炎症介导因子，在人体各种炎症过程中起到重要作用[5]。它由184个氨基酸组成，有两种受体亚型，分别是mIL-6R-α和sIL-6R[6]。研究表明，KOA患者关节滑膜液与软骨组织的IL-6表达水平较正常软骨组织升高[7-8]，且血清IL-6的浓度与KOA患者疼痛程度及影像学严重程度呈正相关[9]，表明IL-6参与KOA的生理病理过程。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase,AKT)是磷脂酰肌醇激酶(PI3K)信号通路中重要的下游靶点，AKT1是其亚型之一。PI3K/AKT信号通路是软骨细胞存活和凋亡的重要调节因子，除调节细胞增殖，还可通过抑制软骨细胞死亡来减少软骨退变，是对抗软骨细胞凋亡的重要途径[10]。PI3K/AKT/mTOR是骨关节炎(OA)中软骨下骨的关键代谢途径。创伤后OA小鼠模型软骨下骨中AKT磷酸化增加，促进成骨分化和成骨细胞增殖，导致异常骨形成[11]。VEGF是一种具有重要促血管生成活性的生长因子，它同时也是炎症细胞因子。它作用于多种细胞类型，具有多种功能，其功能包括刺激血管生成、单核细胞趋化、增强血管通透性和血管舒张等[12]。在晚期OA的关节软骨、滑膜、滑膜液、软骨下等部位均可检测出VEGF表达，且与病情严重程度及疼痛程度呈正相关[13-15]。在VEGF家族中，VEGFA是在OA发病机制中被研究最多的亚型。有研究人员发现，VEGFA可促进基质金属蛋白(MMPs)分泌，通过抑制蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成和表达来抑制关节软骨的变性[16]。

KEGG分析共得到94条相关通路，在排除与KOA关联性较小的通路后，我们团队认为温肾宣痹汤治疗KOA主要通过IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路发挥作用。IL-17是多种炎症细胞因子之一，存在于关节滑膜及软骨细胞中。OA患者血清和滑液中IL-17水平升高，且与病变的X线图像所示严重程度呈正相关[17-19]。IL-17能抑制软骨细胞合成蛋白多糖，促进MMPs组酶的产生[20]。此外，IL-17影响其他细胞因子和化合物的分泌，进而影响OA进程[21]。晚期糖基化终产物受体(RAGE)是免疫球蛋白家族的成员，是晚期糖基化终产物(AGEs)的受体，多种细胞如巨噬细胞和肥大细胞均可表达[22]，AGEs即高级糖基化终产物，是RAGE的配体，由蛋白质与糖的糖基化而形成的[23]，RAGE参与激活促炎反应和各种炎症基因有关的关键信号通路。一方面，AGEs通过激活包括软骨细胞在内的各种细胞的核因子(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)来诱导炎症[24]。另一方面，AGEs可能通过MAPK途径增加PGE2和NO水平，增强OA软骨细胞的炎症反应[25]。肿瘤坏死因子(TNF)超家族在免疫、炎症和控制细胞分化、增殖和凋亡中起着关键作用[26]。在OA患者中，滑液、滑膜、软骨下骨和软骨中的TNF水平均升高，现有研究表明，TNF可抑制软骨细胞中蛋白多糖、连接蛋白和Ⅱ型胶原的合成，刺激MMP-1、MMP-3和MMP-13，28的释放，诱导IL-6和趋化因子的产生[6,27]。

图8 KEGG功能富集分析柱状图

通过以上分析，我们团队认为，温肾宣痹汤治疗KOA主要是通过通过AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路，作用于IL-6、AKT1、VEGFA等核心靶点，发挥控制炎症反应、调节免疫功能、抵抗氧化应激等作用，从而控制疾病的发生发展，体现了多系统、多靶点、多方向的特点，这符合中医学整体与系统论治的观念。未来还需进一步进行严谨细致的实验，以研究温肾宣痹汤治疗OA的确切分子作用机制。