泛素羧基末端水解酶L1、胶质纤维酸性蛋白水平对新生儿窒息脑损伤的诊断价值

郑小冬，祝毓斌，林鲁飞，蔡文燕，吴岳彪

新生儿窒息是一种由各种原因所致母体-胎儿间通过胎盘血流进行气体交换发生急性障碍时，胎儿出现严重缺氧和酸中毒及呼吸、循环、中枢神经系统抑制，致使胎儿出生后不能正常呼吸的儿科临床危重疾病[1]。近年研究表明，中国新生儿窒息发病率呈较高水平[2]。脑损伤指产前、产时、出生后各种病理因素所引起的不同程度的脑缺血或出血性损害，新生儿窒息后主要并发症之一，脑损伤严重时会引发脑瘫等后遗症，影响新生儿生命健康。目前国内外对新生儿窒息后脑损伤相关研究已有较多，但对其早期诊断方面研究仍有不足。因此继续探寻新生儿窒息后脑损伤诊断因子，对及时发现并治疗新生儿窒息后脑损伤有重要意义。程启慧等研究发现，急性缺血性脑卒中患者血清泛素羧基末端水解酶L 1（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L 1，UCH-L 1）水平显著升高，与病情严重程度和预后有关[3]。祝善尧等[4]研究报道，胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）在婴儿痉挛症病儿血清和脑脊液中高表达，有助于判断病儿中枢神经系统受损程度。有研究表明，UCH-L 1和GFAP联合检测可用于评估心脏骤停病儿脑损伤水平[5]。由于UCH-L 1和GFAP在新生儿窒息后脑损伤中联合探究鲜有报道，本研究通过检测新生儿窒息后脑损伤病儿血清UCH-L 1、GFAP表达水平，分析二者与疾病进展关系及对疾病诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2016年1月至2019年5月海口市第四人民医院收治的窒息新生儿126例，病儿日龄1～5 d。根据Apgar评分[6]标准将入组病儿分为重度窒息组57例，其中男30例，女27例，1 min Apgar评分为0～3分；轻度窒息组69例，男38例，女31例，1 min Apgar评分为4～7分。另根据病儿出生后1～5 d颅脑B超、CT或核磁共振扫描结果（是否患有缺血缺氧性脑病[6]），将入组病儿分为脑损伤组（77例）和无脑损伤组（49例）。纳入标准：（1）符合新生儿窒息诊断标准[7]；（2）临床资料完整。排除标准：（1）早产儿；（2）合并患有感染性、先天性代谢类疾病；（3）合并患有黄疸、溶血性疾病；（4）母体孕期患有妊娠期高血压疾病。另选取同期在海口市第四人民医院出生的健康新生儿123例为对照组，健康新生儿日龄1～5 d。本研究中所有受试新生儿近亲属对本研究知情并签署知情同意书。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 主要仪器和试剂多功能酶标仪（型号Multiskan MK3，美国Thermo公司）、UCH-L 1酶联免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（货号JL19379，上海江莱生物科技有限公司）、GFAP ELISA试剂盒（货号JL023505，上海江莱生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本采集及一般资料收集 受试窒息新生儿及健康新生儿均于入组后第2天清晨（7：00～9：00）收集外周静脉血2 mL。4℃、3 000 r/min离心20 min后，于−80℃条件下保存备用。

入组时收集新生儿性别、胎龄、日龄、出生时体重等一般资料，并于出生后14 d时对窒息新生儿进行新生儿神经行为评估（neonatal behavioral neurological assessment，NBNA）评分[8]测定。NBNA 评分总分为40分，<37分为异常。

1.3.2 血清UCH-L 1、GFAP水平测定 采用ELISA法测定所有受试新生儿血清UCH-L 1、GFAP水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学方法使用SPSS 21.0对本研究数据进行分析，计量资料以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组数据比较采用单因素方差分析，总体有差异者再进行LSD-t检验。计数资料以例（%）表示，用χ2检验。Pearson法进行相关性分析，logistic回归模型分析进行危险因素分析，ROC曲线进行诊断价值分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重度窒息组、轻度窒息组及对照组一般资料比较重度窒息组、轻度窒息组及对照组性别、胎龄、平均日龄、出生时体质量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。重度窒息组病儿1 min Apgar评分明显低于轻度窒息组和对照组（P<0.05），轻度窒息组1 min Apgar评分明显低于对照组（P<0.05）。重度窒息组NBNA评分明显低于轻度窒息组（P<0.05）。见表1。

表1 窒息新生儿126例重度窒息组、轻度窒息组及对照组一般资料比较

2.2 重度窒息组、轻度窒息组及对照组血清UCHL 1、GFAP水平比较重度窒息组血清UCH-L 1、GFAP水平均明显高于轻度窒息组和对照组（P<0.05），轻度窒息组血清UCH-L 1、GFAP水平均明显高于对照组（P<0.05）。见表2。

表2 窒息新生儿126例重度窒息组、轻度窒息组及对照组血清UCH-L 1、GFAP水平比较/（ng/mL，±s）

表2 窒息新生儿126例重度窒息组、轻度窒息组及对照组血清UCH-L 1、GFAP水平比较/（ng/mL，±s）

注：UCH-L 1为泛素羧基末端水解酶L 1，GFAP为胶质纤维酸性蛋白。①与对照组比较，P<0.05。②与轻度窒息组比较，P<0.05。

例数123 69 57 UCH-L 1 0.78±0.25 1.36±0.42①2.19±0.71①②201.30 0.000组别对照组轻度窒息组重度窒息组F值P值GFAP 0.48±0.16 1.14±0.28①1.65±0.49①②322.90 0.000

2.3 脑损伤和无脑损伤组病儿血清UCH-L 1、GFAP水平比较脑损伤组血清UCH-L 1、GFAP水平明显高于无脑损伤组（P<0.05），脑损伤组NBNA评分明显低于无脑损伤组（P<0.05）。见表3。

表3 脑损伤和无脑损伤组病儿血清UCH-L 1、GFAP水平比较/±s

表3 脑损伤和无脑损伤组病儿血清UCH-L 1、GFAP水平比较/±s

注：UCH-L 1为泛素羧基末端水解酶L1，GFAP为胶质纤维酸性蛋白，NBNA为神经行为评估。

例数49 77 UCH-L 1/（ng/mL）0.57±0.18 2.31±0.60 19.72 0.000组别无脑损伤组脑损伤组t值P值GFAP/（ng/mL）0.39±0.12 1.76±0.43 21.74 0.000 NBNA评分/分37.24±2.18 31.62±3.11 11.03 0.000

2.4 窒息后脑损伤病儿血清UCH-L 1、GFAP水平与NBNA评分相关性窒息后脑损伤病儿血清UCH-L 1、GFAP水平均与NBNA评分呈负相关（r=−0.471，P=0.000；r=−0.415，P=0.000），见图1，2。

图2 窒息后脑损伤病儿血清GFAP水平与NBNA评分相关性

2.5 新生儿窒息后脑损伤危险因素分析以本研究资料为样本，以新生儿窒息后是否发生脑损伤为应变量建立Logistic回归模型，将1 min Apgar评分、NBNA评分、UCH-L 1水平、GFAP水平转化为二分类变量后为自变量纳入Logistic回归模型，选择逐步向后法、行LR检验。结果显示，低1 min Apgar评分、低NBNA评分、高UCH-L 1水平、高GFAP水平是影响新生儿窒息后脑损伤发生的独立危险因素（P<0.05）。

2.6 血清UCH-L 1、GFAP对新生儿窒息后脑损伤诊断价值由图3分析可知，血清UCH-L 1预测新生儿窒息后脑损伤的曲线下面积为0.802，阈值为1.35，灵敏度为83.10%，特异度为82.00%。血清GFAP预测新生儿窒息后脑损伤的曲线下面积为0.829，阈值为1.12，灵敏度为84.40%，特异度为76.00%。两者联合预测新生儿窒息后脑损伤的曲线下面积为0.876，灵敏度为89.60%，特异度为88.00%。

图3 血清UCH-L 1、GFAP水平对新生儿窒息后脑损伤诊断效能ROC曲线图

3 讨论

窒息新生儿娩出时出现全身皮肤青紫或苍白、呼吸浅表、肌肉张力松弛等症状，可能引起脑损伤等并发症，出现智力低下、肢体抽搐、语言功能障碍、听觉障碍等，给家庭和社会带来严重精神和经济方面压力[9]。早期诊断有助于病情及早发现和控制。本研究结果显示，重度窒息组病儿NBNA评分明显低于轻度窒息组病儿，提示窒息新生儿脑损伤程度随窒息程度增大而加重。

泛素羧基末端水解酶（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase，UCH）与泛素介导的蛋白质降解过程有关。UCH-L 1属于UCH家族成员，具有去泛素化、抑制泛素连接酶活性、稳定泛素单体等作用，可参与细胞增殖、周期、分化、凋亡等过程，与机体炎症、免疫、损伤修复等调控有关[10]，在脑中枢神经和周围神经中分布广泛。Wang等[11]研究发现，UCHL 1可能作为外伤性脑损伤标志物，用于预测患者患病严重程度及预后。有研究证实，新生儿缺氧缺血性脑病病儿出生后24 h血浆中UCH-L 1表达水平升高，与病儿脑损伤加重有关[12]。本研究结果显示，重度窒息组病儿血清UCH-L 1水平均明显高于轻度窒息组病儿和对照组，轻度窒息组病儿血清UCH-L 1水平均明显高于对照组。且脑损伤组病儿血清UCH-L 1水平明显升高，与NBNA评分呈负相关。与Massaro等[12]研究结果相似，提示血清UCH-L 1水平升高可能与新生儿窒息后脑损伤发生及严重程度有关。Li等[13]研究报道，农药中毒后病人血清UCH-L 1升高，检测血清UCH-L 1浓度有助于预测农药中毒后认知功能障碍发生。Carlos等[14]研究发现，促炎因子IL-1β可能通过介导UCH-L 1参与的泛素化过程，影响阿尔茨海默病发生发展。提示本研究中新生儿窒息后脑损伤时可能增加脑组织炎症反应，促进神经元释放UCH-L 1进入血液，影响病儿血清UCH-L 1水平升高。

GFAP是一种主要表达于星形胶质细胞的Ⅲ型中间丝状蛋白，对神经和星形胶质细胞形态功能维持有重要作用。有研究报道，阿尔茨海默病模型大鼠海马组织中GFAP表达水平上调，与神经功能发生障碍后星形胶质细胞细胞活性提高及增殖有关[15]。钱红等[16]研究证实，脑出血后脑损伤大鼠脑组织中GFAP表达水平升高，降低GFAP表达可减轻脑损伤。本研究结果显示，对照组、轻度窒息组、重度窒息组血清GFAP水平依次显著升高，且脑损伤组病儿血清GFAP水平明显高于无脑损伤组病儿，与NBNA评分呈负相关，提示GFAP水平异常升高可能与新生儿窒息后脑损伤发生发展有关。沈露等[17]研究发现，癫痫部分性发作患者血清GFAP水平明显高于对照组，GFAP水平下调预示患者病情好转。Shu等[18]研究表明，脑膜脑脊髓炎患者脑组织中GFAP高表达，与细胞炎性反应增加有关。GFAP与胶质细胞活性和迁移能力密切相关，Feng等[19]研究表明，视网膜受损时GFAP水平上调，激活小胶质细胞，促进炎症因子IL-1β介导的级联反应。提示本研究中GFAP可能通过影响星形胶质细胞增殖、促进脑组织中炎症反应发生，参与新生儿窒息后脑损伤进展。

进一步研究发现，低1 min Apgar评分、低NBNA评分、高UCH-L 1水平、高GFAP水平是影响新生儿窒息后脑损伤发生的独立危险因素。UCH-L 1与GFAP联合预测新生儿窒息后脑损伤的曲线下面积为0.876，灵敏度为89.60，特异度为88.00%。二者联合诊断价值较高，可能作为预测新生儿窒息后脑损伤发生的生物标志物。

综上所述，窒息新生儿血清UCH-L 1、GFAP水平显著升高，与窒息程度及脑损伤发生有关。血清UCH-L 1、GFAP可作为生物标志物，对新生儿窒息后脑损伤有一定诊断价值。但由于本研究样本量有限，因子具体作用机制还需增大样本量全面深入研究。