三色散凝胶贴膏剂的基质处方优化及其对KOA大鼠滑膜炎症的干预效应观察

杨楠,刘子修,张力,廖太阳,茆军,王培民,张农山

(南京中医药大学附属医院/江苏省中医院,江苏省中医外用药开发与应用工程研究中心,江苏 南京 210029)

三色散源自清代末年石氏伤科,后经全国名老中医诸方受先生传承创新,现为江苏省中医院院内制剂,以三色散为主要组成的易层贴敷技术已获国家专利(ZL200820185241.8),并在该院年使用量超过150万贴[1]。三色散由蔓荆子、丹参、白芷、羌活等组成,具有温经通络、散寒除湿、宣痹止痛等功效,主要用于治疗膝骨关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)[1-3]。临床观察三色散可有效改善KOA疼痛、肿胀、关节功能障碍等症状。一项纳入240例KOA患者的随机对照试验中,以三色散为主要组成的易层贴敷技术治疗KOA效果优于复方南星止痛膏对照组[1]。一项纳入160例踝关节急性软组织损伤患者的临床研究中，采用以三色散为主要组成的易层贴敷疗法，其疗效明显优于奇正消痛贴对照组[4]。三色散的传统制备方法(饴糖调和、敷药包扎)存在包扎步骤繁杂、药物易流淌、储存期短等不足,既限制了治疗部位,又无法充分发挥其治疗效果。该制备方法已无法满足日益增长的临床需求量，传统剂型的改良是亟待完成的任务。

中药凝胶贴膏剂是由中药或其提取物与亲水性基质混匀涂布于背衬材料上制成，相比传统贴膏具有许多优势,对皮肤刺激性小,保湿性强、透气性好,可反复揭贴,不污染衣物,使用方便,制备工艺条件简便,易于扩大生产[5]。基质通常由骨架成分(水溶性高分子材料)、交联剂、交联调节剂、保湿剂等组成,其配方比例是凝胶贴膏剂研究的重点,对凝胶贴膏剂的质量优劣有决定性作用[6]。王森等[7]将原本以粉末调敷的处方药制成复方独一味凝胶贴膏,并对其基质处方进行优化,得到性质稳定、工艺可行的凝胶贴膏。黄洋扬等[8]将米醋或白酒调敷的复方活血膏改进制成复方活血凝胶贴膏剂,优选基质处方工艺,解决了原方药给药不便、污染衣物等问题。据此，本研究拟在原方原药的基础上对基质处方进行优化，将其制成配方稳定可行的凝胶贴膏剂，并观察三色散凝胶贴膏剂和三色散传统制剂对KOA大鼠滑膜炎症的干预效应。为了使三色散中的有效成分尽可能透过皮肤，充分发挥其药效，拟在三色散凝胶贴膏剂基质处方中加入促渗剂，初步观察加入促渗剂后的三色散凝胶贴膏剂是否能增强对KOA大鼠的干预作用。

1 材料与方法

1.1 仪器

CAP1003S型千分之一及CAP224D型十万分之一电子分析天平(德国Sartorius公司);KQ-1000型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);22331型高速台式离心机(德国Eppendorf公司);HS3066型涂布机(河北华胜塑胶机械制造有限公司);TYG-Z2L型真空捏合搅拌机(涿州市腾源阁机械厂);CNY-1型初黏性测试仪、CNY-HS型恒温持黏性测试仪、XLW(PC)-500N型智能电子拉力试验机(济南三泉中石实验仪器有限公司);AB7500型qPCR系统(美国Applied Biosystems公司);BioPhotometer型核酸蛋白检测仪(德国Eppendorf公司);170-3930型蛋白电泳仪及转膜仪系统(美国Bio-Rad公司);LAS4000型超灵敏化学发光成像系统(美国GE公司)。

1.2 试剂

三色散(苏药制字:Z040000566)购自南京中医药大学附属医院制剂部;聚丙烯酸钠(批号:S165277)购自上海阿拉丁生物科技公司;甘油(批号:GY20210301)购自山东瑞生药用辅料有限公司;卡波姆(批号:20200701)、甘羟铝(批号:SG-0557)购自上海泛科史康有限公司;酒石酸(批号：R053495)购自上海易恩化学技术有限公司;薄荷脑(批号：X200202)购自黄山天目薄荷药业有限公司;Trizol、逆转录试剂、PCR试剂、ECL化学发光液(批号:R401-01、R222-01、Q331-02、E412-01)均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;BCA蛋白检测试剂盒、RIPA强裂解液、5×蛋白上样缓冲液(批号:P0012、P0013B、P0015)均购自上海碧云天生物技术有限公司;小鼠TNF-α单克隆抗体、小鼠IL-6单克隆抗体、小鼠IL-1β单克隆抗体(批号:sc-52746、sc-57315、sc-12742)均购自美国Santa Cruz公司;兔源β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体(批号:66009-1-Ig)购自美国Proteintech公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)(H+L)多克隆二抗(批号:S0002)购自美国Affinity公司;水为超纯水;其余试剂为分析纯。

1.3 药物的制备

三色散凝胶贴膏剂的制备：将聚丙烯酸钠、甘羟铝加入甘油中搅拌均匀，为A相；将120 g卡波姆加适宜纯水充分溶胀，加入150 g三色散粉末混合均匀，为B相；将B相加入A相中搅拌均匀为C相，取酒石酸加50 mL纯水溶解后加入C相中，真空搅拌均匀涂布于无纺布上，即得三色散凝胶贴膏剂。在三色散凝胶贴膏剂基质处方中另加36 g薄荷脑，制备成三色散凝胶贴膏剂(含促渗剂)。上述三色散凝胶贴膏剂的基质配比用正交实验优化。

三色散传统制剂的制备[2]：将三色散粉末与饴糖按照2∶1的比例搅匀，炼制后涂布于无纺布上，敷上防黏层，即得。

1.4 三色散凝胶贴膏剂的评价指标

参照2020年版《中国药典》第四部通则并查阅相关文献[8-10],以综合感官、初黏力、持黏力、剥离强度为评价指标优化基质处方。综合感官指标权重总占40%,初黏力、持黏力、剥离强度指标权重各占20%。

1.4.1 综合感官 对凝胶贴膏的均匀度、涂布性、皮肤追随性、膜残留性4个方面进行评价,最大值为10分,其余与之相比计算得分,评分标准见表1。

表1 感官评分标准Table 1 Sensory score standard

1.4.2 初黏力测定 取三色散凝胶贴膏剂,除去防黏层,置于底座水平、倾斜角30°的不锈钢板中央,膏面朝上,用涤纶薄膜将钢板上部10 cm和下部15 cm覆盖,中间留出5 cm,将不同规格的钢球从斜面顶端自由滚下,记录被黏住的钢球型号,以测得最大值为20分,其余与之相比计算得分。

1.4.3 持黏力测定 取三色散凝胶贴膏剂,除去防黏层,垂直粘贴于试验板和加载板的中间,用压辊来回滚压3次,垂直固定在试验架上,悬挂1 kg砝码,记录移动位置及脱落时间。以测得最大值为20分,其余与之相比计算得分。

1.4.4 剥离强度测定 取三色散凝胶贴膏剂,将其背衬固定在试验板上,除去防黏层,覆盖一层洁净的聚酯薄膜,用压辊来回滚压3次,除去气泡,将聚酯薄膜自由端对折后夹在试验机上方,试验板夹在下方,以连续稳定的速度剥离二者,记录剥离强度。以测得最大值为20分,其余与之相比计算得分。

1.5 正交实验优化基质处方

根据文献和预实验选取聚丙烯酸钠、甘羟铝、酒石酸、甘油这4种对凝胶贴膏性状影响较大的成分进行单因素考察[11-12]。根据单因素实验结果,采用正交实验对聚丙烯酸钠、甘羟铝、酒石酸、甘油的不同配比进行考察,以综合感官、初黏力、持黏力、剥离强度为指标进行评价,综合评分=综合感官+初黏力+持黏力+剥离强度。正交实验因素水平表见表2。

表2 正交实验因素水平表

1.6 验证实验

按照最终筛选得到的最优基质处方制备3批三色散凝胶贴膏剂,以综合感官、初黏力、持黏力、剥离强度为指标对三色散凝胶贴膏剂进行评价。

1.7 实验动物与分组

健康的SPF级雄性SD大鼠40只,2月龄,体质量180～200 g,由浙江维通利华实验动物技术有限公司提供,饲养于南京中医药大学实验动物中心,生产许可证号:SCXK(浙)2019-0001。实验经过实验动物伦理委员会审批(伦理批号:ACU210101),所有操作均遵循伦理委员会指导规定进行。将大鼠随机分为空白组、模型组、三色散凝胶贴膏剂组、三色散传统制剂组、三色散凝胶贴膏剂(含促渗剂)组，每组8只。

1.8 造模方式

适应性饲养1周后,空白组不造模,其余组采用改良的Hulth法造模,3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠,膝关节备皮消毒,正中切开,暴露关节腔,将髌骨推向外侧,切断内侧副韧带、前交叉韧带,切除内侧半月板,逐层缝合,消毒。用抽屉试验检验造模情况,术后不固定,自由活动。

1.9 给药方式

造模结束后,膝关节备皮,空白组及模型组在双膝关节处给予空白基质贴敷,其余给药组大鼠膝关节表面分别给予三色散凝胶贴膏剂、三色散传统制剂和三色散凝胶贴膏剂(含促渗剂)。医用胶布缠绕后大鼠自由活动。每日给药1次,每次敷贴8 h，共给药28 d。

1.10 组织样本的提取保存

末次给药完成后,采用CO2窒息法处死大鼠。膝关节备皮,纵向切开髌韧带两侧,横向切开髌骨上缘至股骨,向远端翻开游离的髌骨及周围组织,以刀片小心切取滑膜组织,放入4%多聚甲醛和冻存管内保存。

1.11 HE及天狼星红染色

石蜡包埋,切片,常规HE染色及天狼星红染液染色,显微镜下进行观察和摄片,使用Krenn评分评价滑膜炎症情况[13],见表3。按照滑膜细胞增殖、炎性浸润、血管入侵程度等情况计分,每项分值为3分,最后计算总分。

表3 滑膜炎Krenn评分

1.12 Western blot检测滑膜组织中IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达

组织称质量,液氮研磨成粉,加入适量的RIPA强裂解液,按照BCA法测定蛋白浓度,加入5×蛋白上样缓冲液将蛋白煮沸变性,上样电泳,转至PVDF膜上,用5%脱脂奶粉室温封闭1 h,洗膜3次,加入一抗:IL-1β(1∶500)、TNF-α(1∶500)、IL-6(1∶500)、β-actin(1∶5 000),4 ℃孵育过夜,洗涤后加入二抗室温孵育2 h,ECL显色曝光。

1.13 qPCR检测滑膜组织中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达

按照Trizol法提取滑膜组织总RNA,测定其浓度和纯度。将提取的RNA逆转录为cDNA,以cDNA为模板,β-actin为内参,进行PCR扩增,采用2-ΔΔCt法以ABI 7500 v2.0.5软件计算各目标基因mRNA的相对表达量。目的基因及内参基因序列见表4。

表4 引物序列

1.14 统计学方法

2 结果

2.1 正交实验优化基质处方

实验结果表示,R值越大表示该因素对指标的影响越大,表明此因素越重要,可确定4个因素重要先后顺序为B>A>D>C,即影响最大的因素是甘羟铝,其次是聚丙烯酸钠、甘油及酒石酸。基质处方的最佳配比为A2B2C3D3,即聚丙烯酸钠50 g,甘羟铝2.5 g,酒石酸3 g,甘油500 g,正交实验结果见表5。

表5 基质处方优化的正交实验结果

2.2 基质处方优化验证实验

优化后的处方为聚丙烯酸钠50 g，甘羟铝2.5 g，酒石酸3 g，甘油500 g，三色散150 g，纯水50 mL，卡波姆120 g，按照此配比制备的三色散凝胶贴膏剂综合评分较高，表明筛选出的基质处方配比较佳，工艺稳定可行，详见表6。

表6 基质处方验证实验结果

2.3 各组大鼠滑膜HE及天狼星红染色结果比较

HE及天狼星红染色结果显示，空白组滑膜细胞排列整齐，几乎无炎性细胞浸润；与空白组比较，模型组滑膜细胞排列紊乱，炎性细胞浸润明显增加，滑膜纤维化加重，胶原沉积增加，可见较多毛细血管增生；与模型组比较，三色散凝胶贴膏剂组和三色散传统制剂组炎性细胞浸润减少，纤维化程度减轻，胶原沉积减少，可见少量毛细血管增生。与三色散凝胶贴膏剂组比较，三色散凝胶贴膏剂(含促渗剂)组进一步减轻了炎性细胞浸润、滑膜纤维化及胶原沉积，详见图1。

图1 滑膜HE染色切片(×100)及天狼星红染色(×200)Fig. 1 HE(×100) and Sirius red (×200) staining of synovium section

各组大鼠滑膜炎症Krenn评分[13]结果显示,空白组无滑膜炎,模型组为重度滑膜炎，模型组评分显著高于空白组(P<0.01)；三色散凝胶贴膏剂组和三色散传统制剂组为轻度滑膜炎且评分显著低于模型组(P<0.01)；与三色散传统制剂组比较，三色散凝胶贴膏剂组评分无显著差异；与三色散凝胶贴膏剂组比较，三色散凝胶贴膏剂(含促渗剂)组评分显著降低(P<0.05)，详见表7。

表7 大鼠滑膜炎症Krenn评分及分级结果Table 7 Krenn scores and grades of synovitis in

2.4 各组大鼠滑膜IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达量的比较

Western blot结果显示，模型组IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达量较空白组显著增加(P<0.01)；三色散凝胶贴膏剂组和三色散传统制剂组IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达量较模型组显著降低(P<0.01)；与三色散传统制剂组比较，三色散凝胶贴膏剂组IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表达无显著差异。与三色散凝胶贴膏剂组比较，三色散凝胶贴膏剂(含促渗剂)组IL-1β蛋白表达显著下降(P<0.01)，而TNF-α和IL-6蛋白表达无显著差异，详见图2。

注：与空白组比较,**P<0.05;与模型组比较,##P<0.05;与三色散凝胶贴膏剂组比较,图2 各组大鼠滑膜组织IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达比较Fig. 2 Comparison of IL-1β, TNF-α, IL-6 protein expressions in synovial tissues of rats in each group

2.5 各组大鼠滑膜IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达量的比较

qPCR结果显示，模型组IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达量较空白组显著增加(P<0.01)，三色散凝胶贴膏剂组和三色散传统制剂组IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达量较模型组显著降低(P<0.01)。与三色散传统制剂组比较，三色散凝胶贴膏剂组IL-1β、IL-6 mRNA表达显著降低(P<0.05)，而TNF-α mRNA表达无显著差异。与三色散凝胶贴膏剂组比较，三色散凝胶贴膏剂(含促渗剂)组IL-1β、TNF-α、IL-6基因表达显著下降(P<0.05，P<0.01)。详见图3。

注：与空白组对比，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01；与三色散传统制剂组比较，&P<0.05；与三色散凝胶贴膏剂组比较，▲图3 各组大鼠滑膜组织IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达比较Fig. 3 Comparison of IL-1β, TNF-α, IL-6 mRNA expressions in synovial tissues of rats in each group

3 讨论

中药凝胶贴膏主要由背衬层、膏体层和支持层组成,膏体层包含药物和基质,基质主要是亲水性物质,包括骨架材料、交联剂、交联调节剂、透皮吸收促进剂等[14]。基质处方是否合理对膏体的整体性能起着关键作用[15],基质处方优化是制备中药凝胶贴膏剂的重要一环。基质中的骨架材料既能产生黏性,又能与交联剂及交联调节剂形成三维网状立体结构,使膏体具有一定的内聚力和强度。保湿剂对膏体的黏附性及药物的释放等有重要影响,可延缓水分的流失,促进皮肤的水合作用[16]。本实验以聚丙烯酸钠为骨架材料,甘羟铝为交联剂,酒石酸为交联调节剂,甘油为保湿剂。通过前期单因素实验发现聚丙烯酸钠、甘羟铝、酒石酸、甘油的用量对膏体的成型有重要影响。

聚丙烯酸钠用量过多会导致黏性下降,膏体变硬；用量过少会导致内聚力不足,膏体不成型。甘羟铝与聚丙烯酸钠交联可使膏体黏性增强,用量过多反而使膏体黏性降低。甘油用量过少,膏体变稀,导致内聚力不足,贴敷时会有皮肤残留,甘油用量过少导致交联过快,涂布不均匀。酒石酸可与聚丙烯酸钠产生交联,调节适宜的基质强度[17]。最终我们通过单因素实验筛选出了聚丙烯酸钠、甘羟铝、酒石酸、甘油合适的用量范围,采用正交实验对最佳用量进行考察,以综合感官、初黏力、持黏力、剥离强度为评价指标,确定三色散凝胶贴膏剂的最优基质处方配比,通过验证,表明按照最优基质处方制成的三色散凝胶贴膏剂外观平整,黏度适宜,反复揭贴性良好。本实验进一步考察了三色散凝胶贴膏剂和三色散传统制剂对KOA大鼠滑膜炎症的干预作用。通过改良的Hulth法构建KOA大鼠模型，采取HE及天狼星红染色直接观察滑膜病理改变，同时检测滑膜组织中IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白及mRNA表达量。结果显示，KOA大鼠在外用三色散凝胶贴膏剂和三色散传统制剂后，滑膜炎症病理表现明显减轻，相关促炎因子显著下调，表明三色散凝胶贴膏剂和三色散传统制剂对KOA大鼠滑膜炎症均具有良好的干预作用，同时也表明三色散凝胶贴膏剂中的基质处方并未影响三色散药物成分对KOA大鼠滑膜炎症的干预作用。

为了考察加入促渗剂后的三色散凝胶贴膏剂是否能对KOA大鼠滑膜炎症产生更好的干预作用，查阅相关文献后，在三色散凝胶贴膏剂基质处方中加入了薄荷脑，结果显示，与三色散凝胶贴膏剂比较，三色散凝胶贴膏剂(含促渗剂)可显著抑制KOA大鼠滑膜炎症。现代外用透药要求透皮吸收促进剂将药物渗透进入人体皮肤但不能对人体造成严重刺激和损害[18]。促渗剂又分为化学促渗剂和天然促渗剂,目前化学促渗剂研究较多且较常用的为氮酮,具有毒性小、刺激少、促渗效果良好等优点。张莹莹等[19]选择3%氮酮作为促渗剂制备得到的少腹逐瘀凝胶贴膏剂促渗作用好且不影响其外观性能和稳定性。中药促渗剂是天然促渗剂重要的组成部分,可同时发挥促渗和治疗的双重作用,更因其来源广泛、起效快、疗效好、副作用少等优点,引起了研究者的重视[20-21]。薄荷脑已被证明是一种很强的中药促渗剂,邓显仪等[22]发现不同浓度薄荷脑对雪上一枝蒿甲素体内外的促渗作用均具有良好的相关性。若将薄荷脑与化学促渗剂协同应用可以产生更好的促渗作用和更高的安全性,一项研究比较了不同比例氮酮与薄荷脑对吲哚美辛贴剂的促渗效果,发现薄荷脑能明显降低氮酮存在的药物经皮时滞,同时提高促渗强度[23]。若将薄荷脑与中药促渗剂合用则不仅能保证软膏制剂质量,更可协助主药发挥作用[20]。由此可见,薄荷脑在促渗领域应用广泛,疗效显著确切。在本实验中,促渗剂的用量不能太高也不能太低，低浓度的促渗剂很难改变皮肤角质层的结构，对药物透皮吸收作用影响不大，高浓度的促渗剂可能不利于药物透过角质层，阻滞药物渗透[22,24]。因此，根据预实验以及药典和文献，本实验选取36 g薄荷脑是比较合适的用量，后续团队将设计专门的离体透皮实验以比较不同用量薄荷脑的经皮促渗效果。

综上,本研究将名医验方三色散的传统制剂改进成更加稳定方便的三色散凝胶贴膏剂,并在此基础上开展三色散凝胶贴膏剂的药效学研究。最终制备得到的三色散凝胶贴膏剂色泽均匀，无气泡及颗粒感,无脱膏、漏膏及皮肤残留现象,具有良好的黏附性、保湿性,有利于进一步扩大三色散在膝骨关节炎中的临床应用。