基于试验设计方法优化香薷挥发油的提取工艺

陈海鹰，左 晶，左小明，朱珊梅

(1. 常州市第三人民医院 药事科，江苏 常州 213000；2. 常州市第三人民医院 急诊科，江苏 常州 213000）

香薷为唇形科植物石香薷Mosla chinensisMaxim.或江香薷M. chinensis‘Jiangxiangru’的干燥地上部分，具有发汗解表、化湿和中的功效[1]。挥发油是香薷药材的主要药效部位，存在于香薷药材的茎、叶、花部位，气味芳香，除了可以调节胃肠道功能和水液代谢，具有化湿和中的功效[2]，还对多种菌株和病毒的生长具有抑制作用[3-4]，可作为防疫消毒产品的原料[5-6]。香薷挥发油大多由水蒸气蒸馏法制得，提取过程受众多因素的影响，文献报道的提取香薷挥发油的工艺较多，但存在不同学者优化的提取工艺参数不一致的情况[6-8]，不同的工艺参数下制得的香薷挥发油质量可能存在差异。

试验设计（Design of experiment, DOE）方法主要应用于提高试验效率、改进工艺技术、优化产品设计、强化质量管理等方面，近年来越来越多地运用于中药领域[9-10]。适宜的试验设计方法在中药提取工艺参数优化中起着事半功倍的作用。对影响香薷挥发油提取率所有因素进行全因子试验的可行性较差，因此，本研究采用DOE 方法中的Plackett-Burman 设计筛选主要影响因素，Box-Behnken 设计联合响应面分析法优化香薷挥发油的提取工艺参数，验证提取工艺的可行性，以期为改进香薷挥发油的生产工艺和其它中药挥发油提取工艺的优化提供参考。

1 仪器和材料

XP105 型十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；ME104 型万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；挥发油提取器（上海建强玻璃仪器有限公司）；ZNHW型控温电热套（上海锦赋实验仪器设备有限公司）；RE-52CS 型旋转蒸发仪（上海雅荣生化设备仪器有限公司）；YL-060S 型超声波清洗机（深圳语路清洗设备有限公司）。

香薷（批号：200817，产地：湖南省邵阳市），购自安徽省亳州市永刚饮片厂有限公司，经常州市第三人民医院范正达主任中药师鉴定，符合《中国药典》2020 年版（一部）“香薷”项下规定。正己烷（批号：20181018）、氯化钠（批号：20181123）、无水硫酸钠（批号：20160201）均为分析纯，购自国药化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 水蒸气蒸馏法提取香薷挥发油

将香薷药材的花、叶、茎混合均匀，取香薷药材50 g，精密称定，置2 000 mL 圆底烧瓶中，按实验设计参数采用 《中国药典》2020 年版（四部） （2204）“挥发油测定方法”[11]项下方法提取挥发油。收集挥发油，用正己烷冲洗溶解黏在测定器壁上的挥发油，合并所有挥发油，用正己烷分次萃取，合并萃取液，加入适量无水硫酸钠脱水，2 ～ 8℃静置24 h 后过滤，减压除去正己烷，得到香薷挥发油，精密称定重量，计算提取率。香薷挥发油提取率（%） = 香薷挥发油重量/香薷药材重量×100%。

2.2 单因素试验方法考察影响香薷挥发油提取率的因素

2.2.1 浸泡时间 取香薷药材5 份，每份50 g，精密称定，按照“2.1”方法提取挥发油，在提取溶剂为1%氯化钠溶液，液料比为12 mL/g，超声时间为30 min，电热套温度为240℃，提取时间为4 h 的条件下，分别考察浸泡时间（0、15、30、45、60 min）对香薷挥发油提取率的影响，结果见图1A。由图1A可看出，香薷挥发油提取率随浸泡时间的延长变化幅度较小，浸泡时间为30 min 时提取率最高。

2.2.2 超声时间 取香薷药材5 份，每份50 g，精密称定，按照“2.1”方法提取挥发油，在提取溶剂为1%氯化钠溶液，液料比为12 mL/g，浸泡时间为30 min，电热套温度为240℃，提取时间为4 h 的条件下，分别考察超声时间（0、15、30、45、60 min）对香薷挥发油提取率的影响，结果见图1B。由图1B可看出，在0 ～ 60 min 范围内，香薷挥发油提取率随超声时间的延长不断升高，超声时间达30 min 后提取率变化幅度变小。

2.2.3 氯化钠溶液浓度 取香薷药材6 份，每份50 g，精密称定，按照“2.1”方法提取挥发油，在液料比为12 mL/g，浸泡时间为30 min，超声时间为30 min，电热套温度为240℃，提取时间为4 h 的条件下，分别考察氯化钠溶液浓度（0、0.25%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%）对香薷挥发油提取率的影响，结果见图1C。由图1C 可看出，香薷挥发油的提取率随氯化钠溶液浓度的增加呈现先上升后下降的趋势，氯化钠溶液浓度在1%时挥发油的提取率最高。

2.2.4 液料比 取香薷药材6 份，每份50 g，精密称定，按照“2.1”方法提取挥发油，在提取溶剂为1%氯化钠溶液，浸泡时间为30 min，超声时间为30 min，电热套温度为240℃，提取时间为4 h 的条件下，分别考察液料比（8、10、12、14、16、18 mL/g）对香薷挥发油提取率的影响，结果见图1D。由图1D可看出，液料比低于12 mL/g 时香薷挥发油的提取率随液料比的增加而升高，当液料比高于12 mL/g 后提取率有一定程度的下降。

2.2.5 提取时间 取香薷药材5 份，每份50 g，精密称定，按照“2.1”方法提取挥发油，在提取溶剂为1%氯化钠溶液，液料比为12 mL/g，浸泡时间为30 min，超声时间为30 min，电热套温度为240℃的条件下，分别考察提取时间（1、2、4、6、8 h）对香薷挥发油提取率的影响，结果见图1E。由图1E可看出，香薷挥发油的提取率随提取时间的延长而增加，但提取时间达到4 h 后，提取率变化幅度变小。

2.2.6 电热套温度 取香薷药材6 份，每份50 g，精密称定，按照“2.1”方法提取挥发油，在提取溶剂为1%氯化钠溶液，液料比为12 mL/g，浸泡时间为30 min，超声时间为30 min，提取时间为4 h 的条件下，分别考察电热套温度（200、220、240、260、280、300℃）对香薷挥发油提取率的影响，结果见图1F。由图1F 可看出，在200 ～ 260℃范围内，香薷挥发油的提取率随电热套温度的增加而升高，当电热套温度高于260℃后提取率有一定程度的下降。

图1 各因素对香薷挥发油提取率的影响Fig. 1 Effects of each factor on the extraction yield of Moslae Herba volatile oil

2.3 Plackett-Burman 试验设计筛选对香薷挥发油提取率影响较为显著的因素

2.3.1 试验设计与结果 参考单因素试验结果，以香薷挥发油提取率为指标，浸泡时间（A）、超声时间（B）、氯化钠浓度（C）、液料比（D）、提取时间（E）、电热套温度（F）为考察因素，每个因素取两个水平（-1，1）。按Plackett-Burman 试验设计随机生成12个试验组合，根据试验组合按照“2.1”项下方法提取香薷挥发油，计算香薷挥发油提取率，每个试验组合重复三次，取平均值，试验设计及结果见表1。

表1 Plackett-Burman 试验设计及结果Tab. 1 Scheme and results of Plackett-Burman design

2.3.2 显著性分析 采用Minatab 16.0 软件对试验结果进行显著性分析，选择显著性水平达到0.1 的因子作为重要因子，结果见图2。由图2 可看出，六个因素对香薷挥发油提取率的影响从大到小分别为电热套温度、超声时间、液料比、提取时间、氯化钠浓度、浸泡时间。其中，电热套温度、超声时间和液料比是影响香薷挥发油提取率的显著因素，其余因素对香薷挥发油提取率的影响不显著，后续实验将固定浸泡时间为30 min，氯化钠溶液浓度为1%，提取时间为4 h，进一步优化电热套温度、超声时间和液料比的工艺参数。

图2 各影响因素的Pareto 图（Alpha = 0.1）Fig. 2 Pareto diagram of each factor（Alpha = 0.1）

2.4 Box-Behnken 试验设计-响应面分析法优化香薷挥发油提取工艺参数

2.4.1 试验设计与结果 依据Plackett-Burman 试验结果，选取电热套温度（A）、超声时间（B）、液料比（C）为考察因素，每个因素取三个水平（-1，0，1），以香薷挥发油提取率（Y）为考察指标，采用Box-Behnken 试验设计随机生成15 个试验组合，根据试验组合按照“2.1”方法提取香薷挥发油，计算香薷挥发油提取率，每个试验组合重复三次，取平均值，试验设计及结果见表2。

表2 Box-Behnken 试验设计及结果Tab. 2 Scheme and results of Box-Behnken design

2.4.2 模型拟合与方差分析 利用Minitab 软件对实验数据进行多元线性回归和二项式方程拟合，得香薷挥发油提取率与电热套温度、超声时间、液料比三个因素的拟合方程，Y=-14.03 +0.108A+0.057B+0.15C- 2.22 ×10-4A2- 2.95 ×10-4B2- 6.5 ×10-3C2-8.05 ×10-5AB- 0.2 ×10-4AC- 1.5 ×10-3BC， 标准差为0.015，决定系数R2= 97.98%，调整决定系数R2= 94.36%，说明该模型能解释绝大部分变异。由图3 残差诊断图可知，残差诊断图正常，说明该模型与实验数据拟合较好。表3 回归方程的显著性检验结果提示，A、B、C、A2、B2、C2、BC的P＜0.05，说明电热套温度、超声时间、液料比与香薷挥发油提取率不是简单的线性关系，存在二次项效应和交互效应。由表4 回归方程的方差分析结果可看出，回归项P= 0.001 ＜0.05，该回归方程模型显著。失拟项P= 0.163 ＞0.05，说明该方程与实际试验具有较好的拟合性，可用来优化香薷挥发油的提取工艺。

图3 残差诊断图Fig. 3 Residual diagnosis diagram

表3 回归方程的显著性检验Tab. 3 Significant test of regression model

表4 回归方程的方差分析Tab. 4 Variance analysis of regression model

2.4.3 响应面分析法优化提取工艺参数 利用Minitab 软件绘制三维曲面图和等高线图，对任意两因素对香薷挥发油提取率影响的交互作用进行分析，结果见图4。

图4 各因素交互作用对香薷挥发油提取率的响应面图和等高线图Fig. 4 Response surface and contour map of the effects of various factors interaction on the extraction yield of Moslae Herba volatile oil

由图4 可看出，超声时间和液料比的三维曲面图陡峭程度最大，等值线图呈明显的椭圆形，具有显著的交互作用。通过响应优化器得出提取工艺参数的最优化值为电热套温度为245.1℃，超声时间为29.70 min，液料比为12.87 g/mL，预测的香薷挥发油提取率为0.996%。考虑到实际操作简便性，将电热套温度调整为245℃，超声时间调整为30 min，液料比调整为13 g/mL，按照所得到的最优化条件进行三次平行实验，得香薷挥发油提取率为0.989%、0.982%、0.992%，平均值为0.988%，RSD 为0.513%，实测值接近预测值，说明该提取工艺稳定可行。

3 讨论

中药挥发油的提取过程受多种因素的影响，因素之间可能存在交叉作用，前人的研究经验表明，液料比、浸泡时间和提取时间是影响香薷挥发油提取率的重要因素。有文献研究表明，在提取时加入氯化钠，氯化钠的盐析作用可降低挥发油在水中的溶解度，提高挥发油的提取率[12]。将药材在提取前先用超声波预处理，利用超声波的机械效应、空化效应及热效应破碎植物细胞壁，可扩大溶剂与药材的接触面积，提高挥发油的提取率[13]。郑伟然等[14-15]研究发现，不同提取温度影响药液的沸腾情况，继而影响挥发油的出油率。项目预实验过程中发现同一台电热套在不同的设定温度下沸腾情况不同，所得到的香薷挥发油提取率存在差异，推测电热套温度可能通过影响蒸馏速度影响挥发油的提取率。基于此，本实验考察了可能影响挥发油提取过程的六个因素。实验结果提示，超声波辅助对于香薷挥发油的提取具有明显的促进作用，而氯化钠的加入对于香薷挥发油的提取有一定的促进作用，但与电热套温度、超声时间和液料比相比，影响较小。

2020 年版 《中国药典》 （四部）（2204）“挥发油测定方法”[11]通过读取挥发油的体积来测定挥发油的含量，但挥发油提取器的精确度为0.1 mL，挥发油提取工艺参数的不同造成的挥发油体积的细微差异难以读取。因此，本实验采用有机试剂萃取挥发油，再减压蒸馏除去有机试剂，通过称定挥发油质量的方法来计算挥发油提取率。乙醚具有沸点低，极易挥发的优点，可作为萃取溶剂，但因其易制毒和麻醉的特点，购买和使用受到限制，故本实验未采用乙醚作为萃取溶剂，而选择沸点适中的正己烷作为萃取溶剂。

4 结论

本研究采用Plackett-Burman 设计筛选出香薷挥发油提取率的重要因素为电热套温度、超声时间和液料比；采用Box-Behnken 设计联合响应面分析法优化了提取工艺参数、并验证了提取工艺的可行性。然而该工艺是实验室优化的结果，对于香薷挥发油工业大生产时如何进行超声辅助提取，如何通过设定温度来控制药液沸腾状态还需结合生产实际借助试验设计方法进一步探索。