BOX-BEHNKEN设计-效应面法优化黑胡椒中的胡椒碱提取工艺

王 韬， 王志尧， 陈 飞， 常 霞， 马艳妮， 姜 晓

（1.河南省生物技术开发中心，郑州 450002； 2.河南省科学院河南纳普生物技术有限公司，郑州 450002；3.郑州云德生物技术有限公司，郑州 450002）

胡椒在中医临床上应用有黑胡椒和白胡椒两种形式，来源于植物胡椒（Piper nigrumLinn.）不同采收时期的果实，药农在其果实表面颜色由绿色逐渐变为暗绿色时采收并经曝晒干燥后，表面颜色进一步加深，变为黑褐色，故人们称之为黑胡椒. 又因黑胡椒表面具隆起网状皱纹，又名黑川. 胡椒作为一种名贵药材，最早仅在南印度一带种植，目前我国两广、云南等多地也已经引种成功并有大面积种植［1］. 黑胡椒是西式肉食餐饮制作过程中极为常用的调味料，制作牛排时更是必不可少［2］. 胡椒碱作为来源于黑胡椒重要的深加工产品也成为重要的食品添加剂之一［3］. 黑胡椒味辛、性温，功效温中散寒、下气、消痰，是一味常用的中药［4］，其中胡椒碱是黑胡椒最重要的活性成分［5］. 胡椒碱药理作用广泛，具有抗肿瘤［6］、抗氧化［7-9］、抗菌消炎［10-11］、神经保护［12-14］、免疫调节［15］、抗惊厥［16-17］、杀虫［18-19］等作用. 尤其在癌症的治疗方面，胡椒碱具有巨大的药物开发潜力，可以抑制瘤体的生长，达到抗肿瘤的作用，其抗肿瘤作用可能是通过抑制肿瘤细胞的增殖和转移，促进肿瘤细胞的凋亡以及抑制血管生成［20-21］，但在体外实验中胡椒碱类通常是在较高剂量发挥潜在的抗癌作用. 胡椒碱类还能提高姜黄素类的生物利用度，其机制可能是胡椒碱类能抑制了姜黄素的代谢酶活性，同时胡椒碱类还能与姜黄素类结构上的羟基形成氢键，并穿过血脑屏障，使姜黄素类结合能够产生神经毒性引起阿兹海默病的淀粉样蛋白，提高了姜黄素类的生物利用度，从而提升姜黄素类在血清中的浓度［22-23］. 但姜黄素、胡椒碱都有水溶性低、在生理条件下不稳定、肠道吸收少、在体内代谢迅速等特性，导致其在体内易消除、生物利用度极低等现象，限制其临床应用.

虽然胡椒碱在黑胡椒和白胡椒均有发现，但在黑胡椒中的含量明显高于白胡椒. 我们在进行胡椒碱与姜黄素“基于共无定型固体分散技术的抗癌天然活性成分组增溶增效及其作用机制研究”时，需要大量的胡椒碱原料，在调研其制备方法时发现，提取天然来源的胡椒碱的现有工艺包括超临界萃取法、酶解法、有机溶剂提取法、酸溶碱沉法等，普遍存在生产工艺复杂、设备成本高、毒性有机溶剂残留、工业化生产器件安全性较难保证、环境不友好等问题. 而乙醇水溶液作为提取溶剂进行热回流提取，设备成本相对低，无需有毒有害试剂，绿色环保，但利用BOX-BEHNKEN设计-效应面法优化黑胡椒中的胡椒碱提取工艺参数还鲜见诸报道. 本研究优化了从黑胡椒中获得胡椒碱的工艺参数，比文献报道利用乙醇热回流提取方法从黑胡椒中获取胡椒碱的含量高［24-25］，对从黑胡椒中获得天然来源胡椒碱类成分具有一定的参考价值.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑胡椒：郑州市参茸中药材市场；胡椒碱：四川省维克奇生物科技有限公司（批号：20041710，纯度99.71%）；甲醇：Fisher公司，色谱级；娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯.

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司（型号：Agilent1260，DAD检测器）；分析型色谱柱：美国安捷伦科技有限公司（型号：Agilent Eclipse Plus C18，规格250 mm×4.6 mm，5 μm）；万分之一电子天平：瑞士梅特勒-托利多公司（型号：ME204）；十万分之一电子天平：日本岛津（SHIMADZU）公司（型号：AUW220D）；高速万能粉碎机：瑞安市永历制药机械有限公司（型号：111B）.

1.3 实验方法

1.3.1 对照品溶液配制 精确称取胡椒碱0.020 8 g，用无水乙醇定容至10 mL棕色容量瓶，即得.

1.3.2 样品测定的液相色谱条件 流动相采用甲醇-水（体积比77∶23），流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长λ=343 nm，进样量10 μL.

1.3.3 标准曲线的制定 将1.3.1 所得对照品溶液配制成1、2、20、40、100、200 mg/L 的溶液，按照1.3.2 色谱方法进行绘制标准曲线（横坐标为对照品溶液浓度，纵坐标为胡椒碱色谱峰的峰面积），得标准曲线方程为y=55.352 5x+41.815 7（R2=0.998 9），表明在1～200 mg/L 范围内线性关系良好.

1.3.4 样品的处理及胡椒碱得率的计算方法 黑胡椒粉末过4号筛，称取2.00 g，用不同浓度的乙醇-水溶液为提取溶剂，进行热回流提取，合并滤液，减压回收溶剂，所得浸膏转移至50 mL的棕色容量瓶中，甲醇定容.取1 mL置棕色容量瓶，用甲醇定容至10 mL，取续滤液，按照1.3.2色谱条件进行测定，并按以下公式计算胡椒碱得率.

1.3.5 单因素试验 分别考察乙醇浓度、料液比、提取次数和提取时间4个因素对胡椒碱得率的影响.

1.3.6 BOX-BEHNKEN实验设计 根据中心组合试验设计原理，综合单因素影响试验结果，以乙醇浓度、料液比（g∶mL）、单次提取时间和提取次数为自变量，以胡椒碱提取得率为响应值，试验设计见表1.

表1 黑胡椒提取工艺BOX-BEHNKEN分析法实验设计因素与水平Tab.1 Design factors and levels of BOX-BEHNKEN methodology for extraction of black pepper

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取溶剂中乙醇浓度对黑胡椒中胡椒碱得率的影响 当提取溶剂中乙醇体积分数≤80%时，胡椒碱得率随乙醇浓度呈正相关；当提取溶剂中乙醇体积分数≥80%时，胡椒碱得率随乙醇浓度呈负相关，如图1 所示. 因此，乙醇体积分数选择80%左右为宜.

图1 不同浓度提取溶剂对胡椒碱得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of piperine

2.1.2 料液比对黑胡椒中胡椒碱得率的影响 料液比对胡椒碱得率的影响见图2，考虑到得率和成本，料液比选择1∶12.5左右为宜.

图2 料液比对胡椒碱得率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of piperine

2.1.3 提取次数对黑胡椒中胡椒碱得率的影响 如图3所示，提取3次以后胡椒碱得率几乎不变，提取次数选择3次左右为宜.

图3 提取次数对胡椒碱得率的影响Fig.3 Effect of extraction times on the extraction rate of piperine

2.1.4 提取时间对黑胡椒中胡椒碱得率的影响 如图4 所示，当提取时间超过3 h 后胡椒碱得率略有下降，因此，提取时间应选择3 h左右为宜.

图4 单次提取时间对胡椒碱得率的影响Fig.4 Effect of single extraction time on the extraction rate of piperine

2.2 模型方差分析

对胡椒碱提取工艺进行响应面分析，方差分析及回归系数显著性检验结果见表2.

表2 试验设计及其对应的胡椒碱得率Tab.2 Optimization of extraction conditions and results of experimental design

综合考虑单因素试验结果，利用Design-expert 7.0.0统计软件对响应面试验数据进行回归拟合，得到多元二次回归方程模型：

式中：E为胡椒碱得率，%；A为乙醇浓度；B为料液比；C为提取次数，次；D为提取时间，min.

对该回归方程进行方差分析见表3，可以看出，回归模型（P<0.000 1）显著，相关系数R2=0.974 5，失拟项（P=0.231 8>0.05），表明失拟项相对于绝对误差不显著，因此，该模型对试验的拟合程度良好，能较好地反映各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该模型对实验参数进行分析. 由F值的大小可以推断，在所选择的试验范围内，本研究所考察的4 个因素对胡椒碱提取得率影响都有很大的影响，其相关性顺序为：A>D>B>C. 二次项A2、B2、C2和D2影响极显著，交互项AB、AD达到显著水平，表明各因素对胡椒碱得率的影响不是简单线性关系.

表3 方差分析结果表Tab.3 ANOVA of regression analysis

2.3 响应面分析

乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取次数（C）和提取时间（D）4个因素之间的交互作用对胡椒碱得率的影响，如图5～10所示.

图5 E=f（A，B）的响应面及等高线图Fig.5 Response surface and contour plot of E=f（A，B）

图6 E=f（A，C）的响应面及等高线图Fig.6 Response surface and contour plot of E=f（A，C）

图7 E=f（B，C）的响应面及等高线图Fig.7 Response surface and contour plot of E=f（B，C）

图8 E=f（A，D）的响应面及等高线图Fig.8 Response surface and contour plot of E=f（A，D）

图9 E=f（B，D）的响应面及等高线图Fig.9 Response surface and contour plot of E=f（B，D）

分析图5～图10中响应面可知，当乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取次数（C）和提取时间（D）取值较小时，效应面曲线较陡，说明此时A、B、C、D对胡椒碱提取得率影响较为显著，但A、B、C、D取值较大时，效应面曲线较平缓，此时A、B、C、D对胡椒碱提取得率影响较小.

图10 E=f（C，D）的响应面及等高线图Fig.10 Response surface and contour plot of E=f（C，D）

分析图5～图10等高线可知，当A、B、C、D取值较小时，等高线密度大；当A、B、C、D取值较大时，等高线密度较小，说明A、B、C、D取值小时，对胡椒碱提取得率影响较为显著，与响应面规律相同.

经过BOX-BEHNKEN 设计优化提取条件，得到最佳提取工艺参数为：乙醇体积分数83.18%，料液比1∶10.93，提取次数3.22 次，提取时间2.46 h，此时胡椒碱提取得率理论值可达到5.39%. 在此最佳工艺条件下为参考，按照乙醇体积分数83%，料液比1∶11，提取次数3次，提取时间2.5 h，在这样的最优参数下胡椒碱得率可达5.45%.

3 结论

本研究在单因素试验结果的基础上，利用BOX-BEHNKEN 设计-效应面法对黑胡椒中胡椒碱的提取工艺参数进行了优化. 确定最佳提取工艺参数为：乙醇体积分数83%，料液比1∶11，提取次数3 次，提取时间2.5 h. 胡椒碱得率预测值为5.46%，胡椒碱实际得率可达5.45%. BOX-BEHNKEN设计-效应面模型拟合程度达99.81%，实验误差小，对黑胡椒中获得天然来源胡椒碱类成分具有一定的参考价值.