郏县红牛mtDNA D-oop区遗传多样性与母系起源研究

许星龙，夏小婷，陈宁博，黄永震，林凤鹏,祁兴磊，陈 宏，雷初朝*

(1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2. 河南省泌阳县畜牧局，河南 泌阳 463700)

中国古代以农业立国，黄牛是一种重要的农用家畜。长期以来，黄牛作为役用家畜，具有无可替代的作用，既能提供皮毛、牛肉、牛奶等生活资料，又能耕田耙地，故黄牛是中国农业社会生产资料的象征。我国地方黄牛品种分布广泛，遗传资源丰富。目前，我国有53个地方黄牛品种[1]。近年来，对我国地方黄牛品种遗传多样性的研究日益广泛，如：Y-SNPs和Y-STRs父系遗传多态性研究[2-3]、分子考古研究[4]、全基因组重测序研究[5]等，使中国黄牛多元起源的观点成为共识，即普通牛(Bostaurus)和瘤牛(Bosindicus)共同影响中国黄牛的起源驯化，并根据不同影响程度及地理分布可将中国地方黄牛分为北方黄牛，中原黄牛和南方黄牛三大类。

郏县红牛属于中原黄牛，产于河南省平顶山市郏县，因毛色多为红色而得名，使役效果和肉质俱佳，属全国八大良种黄牛。郏县红牛的选育历史悠久，据史料记载，在唐宋时期就已经广泛饲养并有意识地开始选留适合使役的大牛，壮牛。“头如罐，眼如蛋，耳如扇”，“老虎脖子石磙腰，木偶蹄子白尾梢”等谚语就是当地人们在长期选种过程中总结出来的[1]。

目前郏县红牛遗传多样性的研究开展较多，Xia等[6]对郏县红牛全基因组进行重测序并对其遗传多样性进行详细分析，雷初朝等[7]对包括郏县红牛在内的我国八个地方黄牛品种的mtDNA D-loop区进行了系统性研究，但就郏县红牛单个品种而言，mtDNA D-loop区单倍型类型及系统发育进化研究未见报道。本研究对46头郏县红牛mtDNA D-loop区全序列遗传多样性进行分析，从母系遗传角度为郏县红牛保种选育工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在河南省郏县红牛保种场采集35头郏县红牛耳组织样本，以75%乙醇浸泡保存在-80 ℃冰箱中。本课题组曾对35头郏县红牛进行过全基因组分析[5-6]，另从GenBank下载11条郏县红牛mtDNA D-loop 全序列，其登录号为DQ166090-DQ166095，DQ344944，DQ344945，AY119667，AY119668，AY119672，并下载代表普通牛的序列T3(V00654)，代表瘤牛的序列I1(EU177868)，作为普通牛与瘤牛的标准。

1.2 数据处理

将本课题组曾对35头郏县红牛进行基因组测序获得的全基因组数据(SRR11875130-SRR11875159，SRR5507228-SRR5507232)[5-6]，利用生物信息学方法，借助shell脚本从全基因组的bam文件中提取出35头郏县红牛mtDNA D-loop全序列。利用MEGA7软件对46条郏县红牛mtDNA D-loop序列与1条普通牛序列及1条瘤牛序列进行同源比对，经过软件比对以及人工校正，确定所有mtDNA D-loop序列的长度及可靠性。将比对好的序列集合用DNASP5.0软件统计核苷酸多态位点、单倍型类型、单倍型数量、核苷酸多样度、Tajima’s D值、平均核苷酸差异等数据。采用IQ tree的构树方法在FigTree v1. 4. 3软件中构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 郏县红牛mtDNA D-loop区核苷酸变异与单倍型多样性

对46头郏县红牛mtDNA D-loop区全序列进行比对分析，从图1中发现38头郏县红牛mtDNA D-loop区全序列的长度为910 bp，1头郏县红牛mtDNA D-loop区的长度为909 bp，7头郏县红牛mtDNA D-loop区的长度为911 bp，表明郏县红牛mtDNA D-loop区存在1个碱基的插入和1个碱基的缺失。在46头郏县红牛mtDNA D-loop区全序列中共发现60个变异位点，占核苷酸总数的6.59%，其中转换54个(C/T转换33个，A/G转换21个)，颠换5个(A/C颠换3个，A/T颠换1个，C/G颠换1个，A/G/T转换与颠换共存1个)。C+G平均含量为38.5%。

利用DNASP 5.0软件比对分析46头郏县红牛mtDNA D-loop序列，共发现20种单倍型H1-H20，在这20个单倍型中，平均核苷酸差异(k)为23.04，单倍型多样度(Hd)为0.853 0，平均核苷酸多样度(Pi)为0.025 4。根据Tajima’s D值2.235 0(P<0.05)可知，所有变异在进化过程中均遵循中性进化模型。

2.2 郏县红牛系统发育树的构建

以普通牛T3与瘤牛I1的mtDNA D-loop序列为对照，采用IQ tree模型构树郏县红牛的系统发育树(图2)。IQ系统发育树表明郏县红牛20种mtDNA D-loop单倍型分为普通牛和瘤牛两大支系，其中普通牛有14个单倍型(H1、H2、H5、H6、H7、H8、H10、H11、H12、H15、H16、H17、H18与H20)，瘤牛有6个单倍型(H3、H4、H9、H13、H14与H19)，表明普通牛和瘤牛是郏县红牛的两大母系起源。

图1 郏县红牛20个mtDNA D-loop单倍型及其多态位点

图2 基于郏县红牛20个mtDNA D-loop单倍型构建的IQ系统发育树

3 讨论

目前已有较多中国地方黄牛mtDNA D-loop序列遗传多样性的研究[7-11]，但基于较大样本量对郏县红牛mtDNA D-loop序列遗传多样性的研究未见报道。本研究通过分析46头郏县红牛mtDNA D-loop序列，发现C+G的平均含量为38.5%，而A+T的平均含量为61.5%，CG含量低于AT含量，这一结果与中国黄牛mtDNA D-loop序列的研究结果基本一致[7-11]，表明这是黄牛mtDNA D-loop区序列的一个显著特征。在郏县红牛mtDNA D-loop序列中共检测到60个变异位点，其中转换比例很大，有54个，占90%，转换与颠换比为10.8，远高于临界值2.0，这与先前的研究[11]得到相似的结果，表明黄牛mtDNA D-loop序列中的碱基替换，以转换为主。46头郏县红牛mtDNA D-loop序列的单倍型多样度(Hd)为0.8530，平均核苷酸多样度(Pi)为0.0254，单倍型多样度和核苷酸多样度越大，表明品种遗传多样性越丰富，反之则越单一。孙婷等[9]对26头南方黄牛品种——吉安牛进行mtDNA D-loop序列分析，发现其单倍型多样度为0.572 0，平均核苷酸多样度为0.011 3，远远低于郏县红牛，说明郏县红牛的mtDNA D-loop遗传多样性丰富。IQ系统发育树(图2)表明，郏县红牛46个个体构成20个mtDNA D-loop单倍型，分成普通牛和瘤牛两大支系。在郏县红牛46个个体中，普通牛和瘤牛各占23个个体，与蔡欣等[11]的研究中6头郏县红牛各有3个分别属于普通牛和瘤牛支系的结果一致。但普通牛支系23个个体共享14个单倍型而瘤牛支系23个个体仅有6个单倍型，普通牛支系有更多的单倍型，表明郏县红牛在母系形成过程中，更多的普通牛祖先类型参与郏县红牛的品种形成。总之，本研

究发现郏县红牛mtDNA遗传多样性丰富，是典型的中原黄牛，同时受到普通牛和瘤牛的影响，具有普通牛和瘤牛两大母系起源。这些研究结果对郏县红牛种质资源保护、开发与利用[12]具有重要意义。