葛根素对人鼻咽癌CNE-1细胞增殖、凋亡的影响及机制研究

赵 琳，巩 楠，常会敏

鼻咽癌是最常见的耳鼻咽喉部恶性肿瘤，由于其发病早期难以发现及原发部位隐蔽等特点，确诊时大多已属中晚期，并伴有远处转移，故病死率较高[1]。放化疗相结合的方法是目前临床主要治疗手段，但放射反应和化疗药物的不良反应可能会导致不少后遗症的发生，治疗后也常出现肿瘤复发的情况[2]。近年来研究发现，中药辅助治疗因其能增加鼻咽癌对放化疗的敏感性及减少不良反应发生的特点，目前成为抗鼻咽癌研究的热点之一[3-4]。此外，天然植物抗肿瘤药物因其低毒性、高生物利用度等特点已受到了医药学界的广泛关注[5]。葛根素主要是从临床常用的中药葛根当中经过一系列特殊的处理而提取出来的一种异黄酮类化合物。研究表明，葛根素具有抗炎、降压、抗氧化、抗动脉粥样硬化及抗肿瘤等功效，且具有低毒性及高效性[6-7]。目前关于葛根素用于鼻咽癌的研究甚少，本研究以人鼻咽癌CNE-1细胞作为观察对象，探讨葛根素对细胞增殖、凋亡的影响，并分析可能的相关分子机制，为葛根素在鼻咽癌中的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂 人鼻咽癌CNE-1细胞系购置于上海盈公生物技术有限公司，葛根素、10%胎牛血清、胰蛋白酶及RPMI-1640培养基购置于上海碧云天生物技术有限公司，CCK-8试剂盒及Annexin V-PE/ 7-AAD凋亡流式检测试剂盒购置于美国BD公司，细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒、丙二醛（MDA）测试试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒及总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒购于南京建成生物工程研究所。

1.2 细胞培养及分组 将CNE-1细胞复苏，离心收集，用含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素的RPMI-1640培养基培养悬浮细胞，接种至培养皿中，取对数生长期的细胞用于后续实验。0.25%胰蛋白酶消化细胞，终止消化后收集细胞，RPMI-1640培养基冲洗细胞，均匀接种至6孔板中，使其浓度为每孔5×105个，在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育过夜。然后分为对照组、低、中及高浓度组，加入不同浓度葛根素（0，25、50、100 μM），培养48 h。

1.3 检测方法 ①CCK-8检测细胞增殖：将浓度为5×104个/ml的细胞接种于96孔板中，每孔100 μl，每组设3个复孔，同时设置空白对照孔，空白对照孔指的是仅加入培养基而不接种细胞。在不含细胞的培养基中加入CCK-8溶液，培养48 h，测定450 nm的吸光度即为空白组。周围孔加入100 μl PBS，培养箱中孵育过夜。继续培养各组细胞48 h，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃条件孵育2 h，摇床振荡10 min，450 nm处测定吸光度值OD。细胞增殖率（%）=[OD（实验组）-OD（空白组）]/[OD（对照组）-OD（空白组）]×100%；②流式细胞仪检测细胞凋亡：细胞处理如前，按照Annexin V-PE/ 7-AAD试剂盒的说明进行严格操作，在室温中避光反应10 min，同时设置阴性对照（即正常细胞不加Annexin和PI），流式细胞仪上机检测各组细胞凋亡率。③DCFH-DA检测细胞ROS水平：细胞处理如前，去PBS加入稀释好的DCFH 1 ml，在37℃培养箱孵育20 min，每隔3 min混匀一次；流式细胞仪上机检测各组细胞的荧光强度。④MDA含量检测：取不同处理组细胞，按照MDA测试试剂盒说明进行严格操作，取上清于532 nm处测定吸光度值OD，计算细胞MDA含量。⑤T-SOD活性检测：取不同处理组细胞，按照T-SOD测试盒进行操作，于550 nm处的测定吸光度值OD。

1.4 统计学处理 应用SSPS 25.0软件对数据进行独立样本检验和方差分析，组间比较用LSD-t检验，计量资料以±s表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 葛根素对CNE-1细胞增殖的影响 在显微镜下观察细胞形态发现，与对照组比较，各浓度葛根素处理组CNE-1细胞生长受到一定程度的抑制。进一步MTT实验结果显示，与对照组比较，葛根素处理细胞48 h后，各浓度组的CNE-1细胞增殖活力降低，且随着葛根素浓度的升高而降低；各组之间差异均具有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

图1 葛根素对CNE-1细胞增殖的影响（Bar=100μM）

2.2 葛根素对CNE-1细胞凋亡的影响 各浓度葛根素组与对照组比较细胞凋亡率均明显上升，且凋亡率随着葛根素浓度的升高而增加。各组之间互相比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

图2 葛根素对CNE-1细胞凋亡的影响（n=3）

2.3 葛根素对细胞ROS水平的影响 葛根素处理细胞48 h后，各浓度组的CNE-1细胞中ROS水平较对照组均有所增加，且随着葛根素浓度的升高而增加；组间差异具有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

图3 葛根素对CNE-1细胞ROS水平的影响（n=3）

2.4 葛根素对细胞内MDA含量的影响 试剂盒检测细胞MDA含量的实验结果发现，葛根素处理细胞48 h后，各浓度组CNE-1细胞MDA含量较对照组有所增加，且随着葛根素浓度的升高而增加。组间差异具有统计学意义（P＜0.05）（图4）。

图4 葛根素对CNE-1细胞MDA含量的影响（n=3）

2.5 葛根素对细胞T-SOD活性的影响 与对照组比较，葛根素处理细胞48 h后，各浓度组的CNE-1细胞中T-SOD活性减小，且随着葛根素浓度的升高而降低；组间差异具有统计学意义（P＜0.05）（图5）。

图5 葛根素对CNE-1细胞T-SOD活性的影响（n=3）

3 讨论

作为头颈部最常见的恶性肿瘤之一，鼻咽癌的分布具有明显的地域性，全世界80%的患者都在华南地区[8]。鼻咽癌起源于鼻咽上皮细胞，其早期缺乏特异性、侵袭性强及易发生远处转移等为其特点，因此严重威胁人类健康[9]。虽然鼻咽癌对放化疗普遍敏感，但部分患者也难以避免发生疾病进展，转移和复发，导致最终预后较差[10]。鼻咽癌发生发展可能是环境、病毒、基因等多种因素共同参与、互相作用的结果。但目前鼻咽癌的发病机制有待阐明，且缺乏十分有效的靶向治疗手段。寻找辅助药物以减轻鼻咽癌放化疗的不良反应和耐药性已经成为近年来肿瘤领域研究的热点[11]。

豆科葛属植物野葛干燥根即为葛根，是一种临床上广泛用于升阳止泻、解饥退热、透疹以及生津等方面的中药。葛根素主要是从干燥野葛根中提取所得。具有降压、抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗炎及抗肿瘤等药理作用[7]。细胞凋亡是当前肿瘤研究的热点之一，很多抗癌药物的作用机制均与其诱导细胞发生凋亡密切相关。本研究通过观察了葛根素对人鼻咽癌细胞CNE-1增殖、凋亡的影响，结果提示不同浓度葛根素可有效抑制CNE-1细胞增殖，诱导细胞凋亡，且其效应呈浓度依赖性。本研究结果与在乳腺癌，胆管癌，宫颈癌，胰腺癌等中的研究结果一致，提示葛根素对多种肿瘤细胞增殖发挥抑制效应，并能有效诱导细胞凋亡[12-15]。

氧化应激是指细胞在内外环境的刺激下产生过量活性氮类物质（reactive nitrogen species，RNS）及活性氧类物质等活性物质的过程[16-17]。当机体产生的活性物质超出机体的清除能力时，则导致氧化与抗氧化系统之间的平衡失调，会对正常细胞结构和功能造成不可逆的损伤，进一步导致体细胞突变和转化，激活致癌通路促进细胞癌变[18]。正常细胞内代谢活动增强能够破坏自身的氧化应激稳态，诱导肿瘤等多种疾病的发生，而肿瘤细胞对氧化应激的耐受可以直接或间接影响肿瘤细胞耐药性。因此，靶向氧化应激相关蛋白调控细胞的氧化应激水平已经成为防治肿瘤的新策略[19]。大量研究证实，氧化应激异常可通过Fas通路、P53/MPTP通路、NF-kB通路及JNK 通路等诱导细胞凋亡[20]。MDA及SOD是评价氧化应激的重要指标，因此本研究进一步检测了各组CNE-1细胞内ROS、MDA含量以及T-SOD活性，以观察葛根素对肿瘤细胞氧化应激水平的影响。结果发现葛根素能明显上调细胞ROS、MDA水平，降低T-SOD活性，提示在本实验条件下葛根素对CNE-1细胞发挥了促氧化作用，而这种促氧化作用与其诱导细胞凋亡可能有关。众多研究证实，葛根素是一种天然的抗氧化活性物质，对细胞通常发挥抗氧化作用[21-22]。但随着研究的深入，也有研究发现包括葛根素在内的部分黄酮类化合物，在特定条件下如高浓度、长时间作用也表现出促氧化作用，引起机体ROS水平升高，抗氧化酶活性下降等，从而导致生物分子损伤，特别是DNA和蛋白分子[23-24]。

综上所述，本研究提示葛根素能够抑制CNE-1细胞增殖、诱导细胞凋亡，从而发挥抗鼻咽癌的作用，其作用机制可能与葛根素促进细胞内氧化应激有关。现阶段，葛根素在临床上得到广泛应用，葛根素及其衍生物、生物制剂等都取得了显著的抗肿瘤效果，但药物诱导细胞凋亡的途径复杂多样，本研究为更进一步探讨葛根素在治疗鼻咽癌等恶性肿瘤中的应用价值提供了重要参考。