不同规癖水平高产次限位母猪行为、生理及情感状态差异分析

尹国安，杨 森，于浪潮

（1.黑龙江八一农垦大学黑龙江省寒区饲料资源高效利用与营养调控重点实验室，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

富集环境[1]和饲喂高纤维饲粮[2]等条件可提高妊娠母猪生产性能，减少与采食相关规癖行为发生，而现代集约化猪场狭窄、贫瘠及社会隔离生活环境几乎剥夺母猪表达自然行为自由。Garner研究发现在长期限位环境下，母猪多种行为动机受挫，内稳态失调，诱导母猪表现多种口吻部规癖行，其中以无食咀嚼尤为突出[3]。该行为随限位时长增加而加剧，普遍存在于高产次母猪，且存在差异化表现[4]。限位环境也会造成神经生理异常，特征是下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）活动异常，表现为皮质醇激素分泌增多[5]，五羟色胺（5-HT）[6]、多巴胺（DA）[7]等神经生理指标水平异常。但关于高产次母猪规癖行为内在个体特征还有待进一步研究。

规癖行为被认为是母猪一种慢性应激综合征表现[8]。于浪潮在研究中发现，相同产次限位母猪个体间瞳孔收缩扩张时间存在显著差异，暗示其可能存在不同程度心理问题；在不同瞳孔光反射条件下，高产次限位母猪个体间状态行为（站立、俯卧、侧卧）、啃栏行为和啃槽行为表达次数差异显著，同时高产次限位母猪个体间神经生理指标（5-HT、DA、COR）和免疫调节因子（ⅠgA、ⅠL-6、TNFα）含量及新事物刺激反应也存在显著差异[9]。长期或反复应激导致母猪应激激素持续升高，研究表明规癖母猪唾液中皮质醇含量与限位时长呈正相关[10]。环境应激通过调节糖皮质激素在急性期反应中的应答和抑制作用，引起规癖母猪炎症反应，释放白介素-6（ⅠL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-α）等炎症介质[11]。张名岳发现长期限位导致母猪生理应激，血清中免疫球蛋白A（ⅠgA）、ⅠL-6等炎症介质含量升高[4]。此外，长期处于慢性应激也直接影响规癖动物神经系统，持续高水平皮质醇通过垂体、下丘脑和海马体负反馈调节导致母猪机体应激通路（HPA轴和SAM轴）失调[12]，内稳态失衡，导致母猪心理和生理双重应激，表现为中枢神经、代谢和免疫系统紊乱，母猪表现异常情感状态。以上研究表明高产次限位妊娠母猪个体间存在明显心理落差并伴随不同情感状态。张名岳研究还发现瞳孔光反射LAT与T75指标与母猪无食咀嚼行为发生频率显著相关[4]。因此，在长期或反复的慢性应激作用下高产次限位妊娠母猪在表现不同规癖行为特征同时其生理和情感异常也可能存在差异。

本研究通过对限位栏中饲养的六产次妊娠母猪进行行为观察、行为测试（新事物刺激反应、甜味剂苦味剂反应、瞳孔光反射）以及神经生理指标和免疫调节因子等生理指标检测，依据无食咀嚼对母猪进作聚类分组分析不同规癖水平高产次限位母猪生理和情感状态差异。研究旨在阐明母猪规癖行为发生机制，完善规癖母猪精神生理、福利评价体系。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试验设计

本试验于黑龙江省宾县黑龙江大牧人牧业有限公司所属试验猪场完成，选取体况健康、预产期相近的六产次（大白×长白）二元妊娠母猪28头为研究对象。连续3 d观察7:00～10:00和13:00～15:00两个时间段母猪无食咀嚼行为，记录行为时长，计算得到每头个体3 d内平均时长。如图1所示，运用系统聚类分析法，根据平均无食咀嚼时长，把母猪分为高规癖组（8头，10 965.13±321.65 s）、中规癖组（10头，6 535.90±584.55 s）、低规癖组（10头，3 022.70±883.52 s）。从各组母猪中随机选取半数作新事物刺激测试、甜味剂（4%蔗糖）和苦味剂（奎宁）反应测试、瞳孔光反射测试，并用ELⅠSA法测定血清中皮质醇、神经生理指标（5-HT、DA、β-EP）和免疫调节因子（ⅠgA、ⅠL-6、TNF-α）含量。

图1 无食咀嚼发生时长聚类分析树状图Fig.1 Dendrogram of duration of vacuum-chewing by hierarchical cluster analysis

1.2 饲养管理

试验母猪妊娠期和哺乳期均在限位栏（2.15 m×0.65 m×0.96 m）内统一饲养。舍内光照充足，负压通风，配备自动环控系统，恒温恒湿。舍内配备全自动饲喂线，参照妊娠母猪营养标准，每日6:00进行一次定量饲喂，每次每头饲喂3.0 kg全价颗粒饲料，饲料参照妊娠0～95 d阶段营养标准配比：粗蛋白≥15.0%，粗纤维≤10.0%，粗灰分≤10.0%，钙0.5%～1.3%，总磷≥0.4%，氯化钠≥0.3%～1.0%，赖氨酸≥0.5%，水分≤14.0%。同时提供干净充足饮水。舍内定时人工清粪消毒，其他饲养管理程序参照规模化猪场标准。

1.3 血液样本采集

在行为录像前1 d喂料前采血。采血前避免母猪调栏、转群等应激过程。采血方法为前腔静脉采血，具体操作为：使用不锈钢保定绳勒紧母猪上颌并将保定绳另一端固定于限位栏上。保定后使用20 mL一次性注射器采血，每头母猪采血10 mL（分装于抗凝管与促凝管各5 mL），将采血管作好标记。将抗凝管立即放入液氮罐保存，将促凝管中血液静置30 min后，使用离心机4℃下3 000 r·min-1离心10 min，使用移液器分离采血管内血清，并将血清分装于1.5 mL无酶EP管内，作好标记迅速放于液氮罐内保存，所有血液样本置于液氮罐内运输至实验室后转移至-80℃冰箱内长期保存。

1.4 行为测试

1.4.1 新事物刺激测试

将猪转移到一个空限位栏测试，避免人员走动，保持猪舍安静。待母猪完全适应新环境后，将由尼龙绳子制成的绳球悬挂于限位栏前门，绳球与母猪肩同高，之后对母猪探究绳球行为录像，录像时长5 min，每头母猪重复测试3次，每次测试时间间隔＞30 min。此测试评估母猪对新事物反应延迟时间、接触次数及接触持续时长（见表1）。

表1 新事物刺激测试参数类别及定义Table1 Categories and definitions of the indicator in novel object test

1.4.2 甜味剂、苦味剂反应测试

选用国药集团化学试剂有限公司生产的蔗糖分析纯（10021418）及奎宁分析纯（硫酸奎宁二水物，61004234），分别配制甜味剂和苦味剂。甜味剂浓度按照4%蔗糖分析纯溶液配制，苦味剂浓度按照3.193 mmol·L-1奎宁分析纯溶液配制。将配制好的甜味剂与苦味剂分装于注射器，对准母猪口腔持续喷射，观察母猪反应，并根据甜味剂或苦味剂反应测试量化表对其进行评分（见表2和表3），每个体均重复3次测试，测试间隔＞60 min。

表2 甜味剂反应测试量化Table 2 Quantification of sweetener response test

表3 苦味剂反应测试量化Table 3 Quantification of bitter response test

1.4.3 瞳孔光反射测试

利用便捷式瞳孔检测仪（Neur Optics PLR-200 Pupillometer）对不同规癖水平限位母猪测试瞳孔光反射。

Bao等研究表明，母猪瞳孔光反射测试适宜在＜250 lx光照度环境下进行，经测量猪舍光照度发现在8:00～9:00时段光环境符合试验要求。为避免试验误差所有母猪PLR均由同一人完成，每头母猪左右眼均设计3次重复测量，以减少测量误差，每次测量时间间隔5 min以上。测量完成后从测量仪中导出PLR参数包括瞳孔收缩前直径（MAX）、瞳孔收缩峰值直径（MⅠN）、收缩率（CON）、潜伏期（LAT）、恢复扩张75%时间（T75），各项瞳孔光反射参数定义如表4所示。

表4 瞳孔光反射测试参数类别及定义Table 4 Categories and definitions of the indicator in pupil light reflex test

1.4.4 免疫调节因子及神经生理指标差异检测

本试验中不同规癖水平母猪免疫调节因子及神经生理指标均使用酶联免疫吸附测定法（ELⅠSA）测定。

1.5 统计分析

使用Microsoft Excel 2019整理统计行为测试以及生理指标相关数据。使用SPSS 19.0对整理后数据作统计分析，使用Descriptive Statistics中Explore过程检验各项数据是否符合正态分布，除甜味剂和苦味剂反应测试数据外，其他数据均符合正态分布。根据Compare Means中One-Way ANOVA过程对每项测试结果各项参数作单因素方差分析，P＜0.05视为差异显著，P＜0.01视为差异极显著，使用LSD法对各组作多重比较，结果使用平均值±标准差表示。根据Nonparametric tests下Kruskal-Wallis检验分析甜味剂、苦味剂反应评分结果，使用LSD法对各组作多重比较，P＜0.05视为差异显著，P＜0.01视为差异极显著，均使用Excel 2019软件完成制图。

2 结果与分析

2.1 新事物反应

不同规癖水平母猪新事物反应测试结果如表5所示，高规癖组对新事物反应延迟时间极显著高于中规癖组和低规癖组（P＜0.01），中规癖组对新事物反应延迟时间极显著高于低规癖组（P＜0.01）；高规癖组对新事物持续接触时间显著低于低规癖组（P＜0.05）。

表5 不同规癖水平母猪新事物反应测试结果Table 5 Results of novel object test among different groups

2.2 甜味剂、苦味剂反应测试

甜味剂、苦味剂反应测试结果如图2所示，高规癖组甜味剂评分极显著低于低规癖组（P＜0.01），高规癖组苦味剂评分极显著高于低规癖组（P＜0.01）。

图2 不同规癖水平母猪甜味剂反应测试结果（a）、苦味剂反应测试结果（b）Fig.2 Results of sweetener response test(a)and bitter response test(b)among different groups

2.3 瞳孔光反射测试

不同规癖水平母猪瞳孔光反射测试结果如表6所示，高规癖组瞳孔收缩率（CON）显著低于中规癖组和低规癖组（P＜0.05）；高规癖组潜伏期（LAT）时间显著长于中规癖组和低规癖组（P＜0.05）；高规癖组瞳孔扩张恢复75%的时间显著长于低规癖组（P＜0.05）。

表6 不同规癖水平母猪瞳孔光反射测试指标差异Table 6 Results of pupil light reflex test among different groups

2.4 神经生理

如表7所示，对比不同规癖水平母猪神经生理指标差异发现，高规癖组血清五羟色胺（5-HT）浓度显著高于低规癖组（P＜0.05）。

表7 不同规癖水平母猪神经生理指标差异Table 7 Differences of neurophysiological index among different groups

2.5 皮质醇

高、中、低规癖组母猪血清皮质醇含量分别为0.68±0.18a，0.37±0.23b和0.35±0.12b ng·L-1，高规癖组皮质醇含量显著高于中规癖组和低规癖组（P＜0.05）。

2.6 免疫调节因子

如表8所示，对比不同规癖水平母猪免疫调节因子差异发现，高规癖组免疫球蛋白A（ⅠgA）显著高于中规癖组和低规癖组（P＜0.05）；高规癖组白介素-6（ⅠL-6）显著高于低规癖组（P＜0.05）。

表8 不同规癖水平母猪免疫调节因子差异Table 8 Differences of immunoregulatory factor among different groups

3 讨论

3.1 行为测试

母猪在限位栏中活动受限，无法与其他个体互动交流，无法正常表达探究行为，这些均是限位母猪产生应激的原因[13]。任敬一等发现慢性应激诱导的抑郁模型小鼠对新事物反应更迟钝[14]。本研究中，低规癖组到高规癖组新事物测试反应延迟时间越来越长，表明高规癖母猪探究动机更弱，而高规癖母猪新事物接触时间显著缩短，则是对外界新刺激失去兴趣的表现，表征其内在的恐惧与焦虑[15]。高规癖母猪新事物接触中的表现，与人类严重抑郁状态类似。

奖赏系统功能障碍造成快感缺失和动机缺失等多方面损害[16]。快感缺失是抑郁症典型表现，抑郁情绪降低实验对象对蔗糖的偏好[17]。行为受限的猕猴也表现快感缺失，对蔗糖偏好度降低，对奎宁偏好度增加[18]。本研究中，高规癖母猪的蔗糖喜好程度较低，显示其存在一定的快感缺失。高规癖母猪未表现明显苦味剂愉悦反应，其对奎宁较弱的厌恶反应与对外界新刺激反应减弱一致。在抑郁模型以及酒精依赖模型动物中均发现动物对苦味剂反应不敏感[19]，说明高规癖母猪具备典型的抑郁特征。在高产次限位母猪中，规癖水平更高的个体抑郁心理更明显，但程度尚未达到重度抑郁。

3.2 瞳孔光反射

瞳孔光反射（PLR）是神经中枢交感和副交感系统作用变化的假定标志，可通过PLR测试检测自主神经系统是否处于平衡状态[20]。李想研究证明，母猪具有瞳孔强直特征与啃槽、无食咀嚼行为相关[6]。本研究中，高规癖组瞳孔收缩率（CON）显著低于中规癖组和低规癖组，高规癖组潜伏期（LAT）显著高于中规癖组和低规癖组，高规癖组瞳孔扩张恢复75%的时间（T75）显著高于低规癖组，表明高规癖组母猪出现瞳孔光反射异常特征。CON主要取决于瞳孔收缩幅度，CON变化可能与动物焦虑程度有关。猕猴杏仁核遭到损伤后其CON低于正常状态[21]。Nagai等研究也表明焦虑程度越严重，瞳孔收缩幅度越小[22]。本试验中，高规癖组较低的瞳孔收缩率说明长期限位饲养与单一生长环境使高规癖组心理受挫严重并处于一种焦虑状态。Fan等研究结果表明抑郁症患者瞳孔扩张恢复75%的时间比正常人更长[23]。Zhang等研究发现限位母猪瞳孔收缩开始的潜伏期更长[24]。Lv等研究表明随母猪瞳孔扩张恢复75%时间增加，其前额叶皮质出现更多炎性细胞，表明瞳孔扩张恢复75%时间延长的限位母猪海马和前额叶皮质的组织损伤可能是慢性应激或抑郁的结果[25]。这些结果表明母猪瞳孔光反射异常改变可能与限制活动导致的慢性应激或抑郁状态有关。吕芳璐等在妊娠母猪中也发现瞳孔光反射时长增加等瞳孔强直现象[26]。故在此试验中，高规癖组处于长期应激和慢性抑郁状态，而中规癖组和低规癖组各项瞳孔光反射检测指标无显著差异，表明这两组母猪心理状态尚可。

3.3 生理指标

本研究中，高规癖组血清五羟色胺（5-HT）和白介素-6（ⅠL-6）显著高于低规癖组，高规癖组皮质醇（COR）和免疫球蛋白A（ⅠgA）显著高于中规癖组以及低规癖组。5-HT神经传递受阻与抑郁症病因有关[27]，结合奖赏与厌恶反应，5-HT和DA在奖赏反应中发挥重要作用[28-29]，DA不仅传递积极奖赏，还同时传递厌恶或警报信号[30]。Li等研究发现，母猪无食咀嚼行为与5-HT水平呈正相关，同时在高规癖组中发现PLR反应延迟时间增加及5-HT水平升高[31]。本研究中高规癖组5-HT水平也较高。高规癖母猪5-HT水平升高与典型抑郁症患者特征相矛盾，原因可能是高水平无食咀嚼刺激奖赏系统，导致5-HT和DA水平升高。

COR浓度是衡量动物应激或正在遭受应激程度的指标，李庆等发现抑郁症模型大鼠血清中皮质醇含量升高[32]。高规癖组母猪皮质醇浓度较高，是母猪长期慢性应激产生抑郁的表现。COR水平升高可能与母猪慢性应激导致下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（HPA）失调有关，β-EP在这个过程发挥重要作用[33]。应激引发相关精神疾病中存在炎症反应，ⅠgA、ⅠL-6是抑郁症炎症标志物。Simeonova等研究表明重度抑郁症患者血液中ⅠgA含量高于常人[34]；Ghosh等在脂多糖诱导的外周炎症小鼠中发现促炎细胞因子ⅠL-6水平升高，且炎症反应诱发小鼠表现类抑郁行为[35]。本试验中高规癖组血液ⅠgA和ⅠL-6含量较高也与其抑郁样行为表象一致。中规癖组和低规癖组母猪各项生理指标，说明精神状态良好。

4 结论

不同规癖水平高产次限位母猪行为生理及情感状态存在差异，高规癖组表现探究动机减弱、快感不足、瞳孔反射异常，COR、5-HT、ⅠgA、ⅠL-6水平升高，其情感、生理异常均与抑郁状态更相符；中规癖组仅表现一定程度新事物反应迟钝和快感减弱，抑郁生理特征不明显；低规癖组不具备典型抑郁特征。综上，高产次限位母猪存在不同抑郁状态，通过规癖分组可明显区分，高规癖母猪与抑郁症一致。