抗生素诱导的微生物组耗损后促进空肠弯曲菌在小鼠肠道定植

陈浩浩,张艳芳,潘晓明,高素华,张辉,楼宏强*

(1.金华职业技术学院医学院分子生物学实验室,浙江 金华 321007;2.金华市食品药品检验检测研究院动物中心,浙江 金华 321000)

我国的李春岩院士团队在20世纪90年代时从吉兰-巴雷综合征患者粪便里成功分离出了空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni),并经口灌胃构建了周围神经损伤的依沙巴布考克鸡模型[1]。此外研究人员用空肠弯曲菌菌株灌胃家兔[2]、小型猪[3]以及豚鼠[4]等,也观察到了实验动物出现神经病理损伤。然而对于这些实验动物的使用是比较有限的,不仅成本高、可重复性差,还缺乏足够的免疫和遗传工具来深入研究这些动物[5]。小鼠通常作为首选的感染动物模型,却没有在空肠弯曲菌感染相关模型中得到广泛应用[6-7]。研究显示,小鼠肠道菌群,尤其是拟杆菌属、梭状芽孢杆菌及乳酸杆菌等,竞争性阻止了空肠弯曲菌在小鼠肠道内的定植,从而使小鼠不易感空肠弯曲菌[8-9]。

抗生素诱导的微生物组耗损(antibiotic-induced microbiome depletion)是近几年兴起的一种可替代无菌小鼠用于研究肠道微生物群在某些病理条件下作用的新方法[10-12]。通常认为,动物肠道内的共生菌群能阻止外源性病原体的侵入,是宿主防御的重要组成部分[13]。肠道菌群以多种方式抵抗病原体,包括消耗病原体生存必需的营养、产生细菌素和有机酸、改变肠腔内的pH值或者利用肠道内有限的氧气等[14-15],而抗生素打破了肠道菌群的平衡,还导致细菌裂解、碳源释放以及胆汁酸水平的升高[16]。本研究利用头孢哌酮钠舒巴坦钠诱导肠道微生物组耗损,建立一种空肠弯曲菌在C57BL/6小鼠肠道定植的方法,为后续空肠弯曲菌致病性相关的研究提供基础条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

36只8～10周龄SPF级C57BL/6雌性小鼠,体重18～20 g,购自杭州医学院【SCXK(浙)2019-0002】,饲养于金华市食品药品检验检测研究院动物中心【SYXK(浙)2021-0009】,给予灭菌饮用水及食物,昼夜各半循环照明,湿度恒定,温度控制在22～25℃。所有的动物实验经金华职业技术学院实验动物伦理委员会批准(审批号:JHCDW2021003),在整个实验过程中,如果小鼠表现出极度痛苦或体重下降超过15%的迹象,就对其实施安乐死。空肠弯曲菌购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC22936,ATCC33291),接种于哥伦比亚血琼脂平板上,微需氧条件下42℃培养48 h。

1.1.2 主要试剂与仪器

注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠购自辉瑞制药,QIAamp® FAST DNA Stool Mini Kit购自QIAGEN公司,细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司,iTaq Universal Probes supermix及兔抗空肠弯曲菌多克隆抗体购自Bio-Rad公司,驴抗兔IgG H&L二抗购自Abcam公司,PCR引物及荧光探针由上海生工生物工程有限公司合成,16S rDNA法测序及分析委托上海天昊生物科技有限公司完成。荧光定量PCR仪(CFX96,Bio-Rad公司,美国),正置荧光显微镜(BX53,奥林巴斯,日本)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型构建及分组

将小鼠随机分为3组,分别为正常组(n=6)、对照组(n=15)及实验组(n=15),适应性喂养7 d后,实验组灌胃200 μL的注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠(50 mg/mL),第2天重复灌胃1次,对照组使用200 μL生理盐水灌胃替代,正常组不做任何处理。第3天实验组和对照组分别灌胃200 μL含空肠弯曲菌(4.0麦氏浊度,约1.2×109CFU/mL)生理盐水溶液,建模完成[12,17]。

1.2.2 小鼠肠道细菌多样性分析

在建模后第1、2、3天,麻醉小鼠(每组3只),脱颈安乐死,立即解剖小鼠,取末端回肠、近端结肠及盲肠,收集内容物,参照QIAamp® FAST DNA Stool Mini Kit说明书步骤分离纯化DNA,送生物技术公司进行16S rDNA法鉴定细菌种属。

1.2.3 探针法qPCR检测粪便空肠弯曲菌

建模后第1～7天,每日收集小鼠新鲜粪便,提取粪便细菌DNA。另于第7、14天取末端回肠、近端结肠及盲肠,收集内容物,微需氧条件下42℃液体培养液增菌培养24 h,收集菌液,采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA。取5 μL作为模板,分别10 μmol/LHipO上下游引物及探针各0.5 μL(序列见表1),2×iTaq Universal Probes supermix 10 μL,ddH2O 3.5 μL。94℃3min;93℃30 s,55℃45 s,40个循环;Bio-Rad CFX96 PCR仪上进行扩增,同时扩增已知梯度浓度的空肠弯曲菌DNA,构建Cq值和拷贝数的对数拟合曲线方程,之后根据各样本扩增产物Cq值进行拷贝数的绝对定量。

表1 空肠弯曲菌HipO基因特异性引物及探针序列Table 1 HipO gene-specific primers and probe sequences of C.jejuni

1.2.4 组织学检测

分别在建模后第1、2、3、7天,取动物的回肠、结肠及盲肠组织,4%多聚甲醛溶液固定,梯度乙醇脱水,石蜡包埋、切片,经脱蜡,水化,柠檬酸钠缓冲液抗原修复,TritonX-100透膜,加封闭液后湿盒中37℃孵育30 min。弃封闭液,加一抗(兔抗空肠弯曲菌,1∶100)4℃孵育过夜,加二抗(Donkey Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647,1∶200)37℃孵育1 h,DAPI染色,抗淬灭荧光封片剂封片,荧光显微镜拍照计数。对建模后第3、7天的回肠、盲肠及结肠石蜡切片进行苏木精、伊红染色后拍照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 16S rDNA法鉴定回肠、结肠及盲肠细菌种属

委托生物公司进行了肠道内容物16S rDNA测序法分析了细菌群落组成(见图1),结果显示,对照组回肠内容物中乳酸杆菌属(Lactobacillus)相对丰度较高,盲肠及结肠内容物中拟杆菌属(Bacteroides)相对丰度较高,实验组肠道内容物中皆是肠球菌属(Enterococus)相对丰度较高。另外,在建模后第1天实验组肠道中检测到较高丰度的弯曲菌属(Campylobacter)。

图1 16S rDNA测序分析3组肠道内容物细菌群落结构结果Figure 1 Bacterial community structure of the intestinal contents in 3 groups analyzed by 16S rDNA sequencing method

2.2 小鼠粪便检出空肠弯曲菌

建模后收集小鼠粪便,持续7 d,利用探针法qPCR检测空肠弯曲菌HipO基因,得出Cq值(见图2)和拷贝数的对数拟合曲线方程y=-0.303x+13.379(R2=0.9995),将各样本的Cq值代入公式后计算拷贝数。结果显示,在建模后第1～3天的实验组动物粪便中能检测到较高拷贝数的空肠弯曲菌(P＜0.01,见表2),而对照组动物粪便仅在第1天检出较高拷贝数的空肠弯曲菌。对实验组第7、14天肠道内容物增菌培养后,在第7天的盲肠和结肠内容物中检测到了较高拷贝数的空肠弯曲菌,分别为(1850±116)及(1238±182),在第14天的结肠内容物空肠弯曲菌拷贝数(2990±195)。

表2 绝对定量2组空肠弯曲菌HipO基因拷贝数Table 2 Absolute quantification of C.jejuni HipO gene copy number in 2 groups

图2 探针法qPCR检测3组空肠弯曲菌HipO基因的Cq值Figure 2 Cq value of C.jejuni HipO gene in 3 groups detected by TaqMan qPCR

2.3 空肠弯曲菌在小鼠肠道定植

我们对建模后第1、2、3及7天时小鼠的回肠、结肠及盲肠组织进行了空肠弯曲菌(红色)的免疫荧光染色。结果显示,第1、2及3天实验组的回肠、结肠、盲肠管腔内可见明显的红色荧光标记的空肠弯曲菌,第7天时肠道内未见明显的红色标记(见图3);对照组在第1天结肠可见少量的红色标记,其他时间段未见红色明显红色荧光标记。

2.4 空肠弯曲菌短期定植未引起小鼠肠道炎症反应

建模后第3、7天的回肠、盲肠及结肠HE染色结果显示,实验组小鼠肠道黏膜基本完整,未见明显的炎症细胞浸润(见图4)。

图4 建模后第3、7天小鼠肠道组织HE染色Figure 4 HE staining of mouse intestinal tissue at 3,7 d post modeling

3 讨论

空肠弯曲菌的宿主较广泛,包括禽类和哺乳类动物,也是弯曲杆菌属中最主要的引起全球范围内人类胃肠炎的致病菌之一。空肠弯曲菌不能在小鼠的消化道内定植,小鼠肠道菌群被认为是阻止了空肠弯曲菌定植的重要因素之一[16,18],动物的肠道有大量微生物定居,每克结肠粪便中的细菌含量超过1011个[13]。在本研究中,利用头孢哌酮钠舒巴坦钠连续灌胃2 d,诱导小鼠肠道微生物组耗损,引起肠道菌群平衡失调[19],使空肠弯曲杆菌能够在小鼠肠道中定植。通过肠道内容物细菌群落组成分析结果表明,回肠中的乳酸杆菌,盲肠及结肠中的拟杆菌属,可能是对病原体提供定植抗性的重要菌群[20-21]。

一般认为在新鲜粪便中出现或直接从动物肠道中培养出空肠弯曲菌,即可认为空肠弯曲菌在消化道内定植成功。在本研究中,在建模后的前3 d的小鼠粪便中都检出了较高拷贝数的空肠弯曲菌,此外在肠道组织切片中,通过免疫荧光染色也证实了空肠弯曲菌在小鼠肠道的定植。在对建模后第7、14天小鼠肠道内容物进行增菌培养后,仍能在结肠内容物中检出了少量的空肠弯曲菌,但组织病理学检测也未发现明显的炎性细胞浸润,提示空肠弯曲菌可能没有进入肠道组织的深部。空肠弯曲菌依赖鞭毛的定向趋化运动,穿越黏膜表面黏液层到达空肠及回肠黏膜细胞表面定植。趋化蛋白(chemotaxis protein,CheY)负责将感觉信号从空肠弯曲菌的化学感受器传送到鞭毛,能调节鞭毛的顺时针旋转,研究显示,空肠弯曲菌的CheY失活后,其鞭毛的运动性和侵袭力没有改变,但丧失了化学趋化性,造成它不能在动物的肠道细胞内定植[22-23]。刘硕[24]采用经口灌胃攻毒昆明小鼠,收集粪便分离培养空肠弯曲菌,之后用分离菌株继续攻毒新一批小鼠,连续传代十八代,从而得到了毒力增强且稳定遗传的分离株。本研究采用建模的菌株为空肠弯曲菌质控标准菌株ATCC33291,如果采用其他侵袭性及致病性更强的菌株,可能就会有不同的实验结果。

消化道具有复杂的免疫系统,包括免疫细胞、免疫组织和免疫作用因子等,它们之间通过持续有效的相互作用消除侵入的致病菌[25-26]。当小鼠体内的免疫系统出现变化时,空肠弯曲菌就可以在其肠道内定植,有研究者在空肠弯曲菌攻击免疫缺陷的转基因小鼠前给予口服氨苄西林、万古霉素等广谱抗生素,结果发现空肠弯曲菌在结肠、肠系膜淋巴结及脾等部位定植[8,17,27]。此外,空肠弯曲菌能有效地在无菌小鼠的肠道内定植,并向其免疫组织器官传播[28]。可是不管是免疫基因缺陷小鼠还是无菌小鼠,都极大地改变了小鼠的免疫系统,不能有效模拟空肠弯曲菌在健康人肠道的感染以及后续诱发的相关疾病。另外,近期高通量肠道宏基因组测序分析提示性别因素是对肠道菌群影响最大的[29],在本研究中,为了肠道菌群保持相对一致,同组小鼠保持同笼饲养,另外饲养周期大于2周,所以选取了雌性的小鼠。那么性别或者激素是否会影响空肠弯曲菌的定植,这是一个指得继续深入研究的问题。

综上所述,本研究证实了经头孢哌酮钠舒巴坦钠诱导的微生物组耗损后能促进空肠弯曲菌在小鼠肠道内的短期定植,但如果要维持持续定植并产生致病性仍需要更深入的研究,寻找更合适的方案。