枸杞子干预阿尔茨海默病作用机制的网络药理学研究

冯春玲 史革鑫 郭 硕 王 蕾，2

1.山东第一医科大学（山东省医学科学院）药学院，山东泰安 271016；2.山东第一医科大学（山东省医学科学院）药理学研究所，山东泰安 271016

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一种常见、隐性发病、呈进行性发展、病因不明并且以记忆衰退、认知功能障碍、情感控制能力下降和社会行为退化为主要临床特征的神经退行性疾病。随着人口老龄化加剧，AD发病率逐年递增。AD主要病理特征是神经元丢失、神经纤维缠结和老年斑。AD发病机制学说很多，Aβ沉积学说和tau蛋白过度磷酸化学说是最主要的学说［1］。目前，临床治疗药物以西药为主，如多奈哌齐、卡巴拉汀、盐酸美金刚等，可适度发挥改善早期临床认知功能障碍的作用［2］。但由于该病发病机制复杂，属于多因素多靶点的进行性发展的疾病，单因素、单靶点的治疗药物尚未达到理想效果，不能有效逆转病程的进展；临床上关于多因素的联合用药研究不多，多因素治疗的效果和安全性无从保障。因此，具有多靶点、多途径、多环节作用特点的中药已表现出独特的优势，以综合整体观念，辨证论治为特色的中医药在治疗AD中发挥的作用日益引起重视。

枸杞子（Fructus Lycii）多为宁夏枸杞的干燥成熟果实，作为食药两用的中药材，用药悠久。其最早记载可追溯到东汉《神农本草经》，枸杞子被列为上品，曰“久服坚筋骨，轻身不老，耐寒暑”。其后，枸杞子陆续出现在历代典籍中，如南北朝《本草经集注》中记载“味苦寒，主五内邪气，热中，消渴，周痹，坚筋骨”；明《本草蒙筌》中记载“明耳目安神，耐寒暑延寿，添精固髓，健骨强筋”等［3］。枸杞子含有枸杞多糖、类胡萝卜素、黄酮类化合物、挥发油类化合物、甜菜碱、多种氨基酸、维生素以及各种微量元素等多种活性成分［4］。目前药理研究发现，枸杞子具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗AD、调节免疫及神经系统功能、增强机体造血功能等药理作用［5-6］。枸杞子作为中草药的一种，成分复杂，具有多靶点、多通路的作用特点，而网络药理学这一新兴学科是将传统的单一靶点、单一药物的研发原则转换为多向药理学、药物作用于生物网络模式［7］，这一理念与中草药的作用特点相契合。本研究旨在探讨枸杞子干预AD 的功效作用网络，深入挖掘潜在的活性成分和可能作用机制，为后续的研究提供方向。

1 材料和方法

1.1 数据库 见表1。

表1 成分靶点与疾病靶点数据库

1.2 软件

Cytoscape 3.6.1软件。

1.3 枸杞子化学成分收集筛选及潜在作用靶点预测

运用TCMSP数据库检索枸杞子的化学成分，以其吸收、分布、代谢、排泄（ADME）参数中的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、类药性（druglikeness，DL）、血脑屏障（blood brain barrier，BBB）设置条件进行筛选，其中OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18、BBB ≥- 0.30，建立枸杞子化学成分数据信息表。另外，通过查找文献补充已报道有相关抗AD 作用但未被纳入上述筛选条件的候选活性成分。将筛选出的候选活性成分联合运用TCMSP、PubMed、Swiss Target Prediction数据库进行成分靶点预测，同时利用UniProt 数据库查询靶点蛋白对应的基因名称，汇总并整理为Excel表格。

1.4 AD靶点预测

设置检索词“Alzheimer′s disease”，运用CTD、TTD、DisGeNET、DrugBank、OMIM、PharmaGKB、GAD、PubMed 数据库检索并筛选AD 相关作用靶点，然后运用UniProt 数据库中UniProtKB 检索功能获得标准化作用靶点基因名以及对应的UniProt ID。将上述结果汇总、去重，即为AD 作用靶点库。

1.5 成分靶点与AD靶点的映射

利用Excel 表格的查重、排序功能，取枸杞子各化合物的作用靶点与AD 作用靶点的交集，即枸杞子各活性成分干预AD 所作用的靶点，汇总并整理表格。

1.6 网络构建和分析

利用Cytoscape 3.6.1 软件构建枸杞子干预AD的活性成分-作用靶点网络图。将上述网络图中的各个节点以Degree（自由度）、Closeness（节点紧密度）和Betweenness（节点介度）的中位数为界，选取同时满足此3 个条件的关键靶点［8］；最后利用ClueGO插件，对得到的关键靶点进行ClueGO分析、Pathway富集通路分析，设定阈值P＜0.01。研究化合物可能作用的生物学通路、靶点之间的相互关系，预测枸杞子干预AD的作用机制。

2 结 果

2.1 枸杞子活性成分靶点预测结果

通过TCMSP数据库检索得到188个枸杞子化合物成分。根据OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18、BBB ≥ -0.30筛选后得到40 个化合物。周正群等［6］对枸杞子中单体化合物进行体外抗AD 和抗氧化活性的评价，结果显示部分化合物具有抗氧化能力和DPPH 自由基清除活性。通过文献查找补充15 个候选活性成分［6，9-10］（表 2），主要有槲皮素、芦丁等黄酮类化合物，联合运用 TCMSP、PubMed、Swiss Target Prediction、UniProt数据库查找其对应的作用靶点蛋白及基因名，最终查询获得54个化合物相应的靶点及基因。

表2 经文献查找补充的候选活性成分

2.2 AD靶点预测结果

以“Alzheimer′s disease”为检索词，检索多种数据库，汇总得到AD 预测靶点。其中CTD 数据库靶 点 90 个；TTD 数据库 84 个；DisGeNET 数据库 122 个；DrugBank 数据库 85 个；OMIM 数据库129 个；PharmGKB 数据库 7 个；GAD 数据库 684 个；PubMed 数据库1 040 个，汇总去重，共计靶点1 581 个。

2.3 枸杞子化学成分-作用AD靶点网络图

根据枸杞子干预AD 的化学成分-作用靶点建立两个新的表格，其中一个为属性文件。利用Cytoscape3.6.1 软件创建枸杞子干预AD 的化学成分-作用靶点网络图，如图1。其中Nodes：400，Edges：2643，即有化合物和作用靶点共400个，其中化合物54 种、作用靶点346 个；相互关系2 643 条；由此可体现枸杞子干预AD具有多靶点、多成分、多通路的作用特点。

图1 枸杞子干预AD的化学成分-作用靶点网络图

2.4 网络筛选主要活性成分和关键靶点

利用Cytoscape 3.6.1软件，以Degree、Closeness和Betweenness值筛选主要活性成分及关键靶点，构建核心网络图（图2），得到关键靶点29个（表3），化学成分49 种。其中自由度较高的靶点是PTPN1、AR、CYP19A1、ACHE、HSD11B1，自由度较高的成分主要是槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（betasitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）等，排名前十的成分见表4。

图2 枸杞子干预AD核心网络

表3 枸杞子干预AD关键作用靶点

表4 枸杞子干预AD的主要活性成分

2.5 ClueGO及Pathways分析

利用ClueGO 插件对枸杞子干预AD 的29 个关键靶点进行GO 分析。其中生物过程（biological process）分析结果显示，枸杞子干预AD 主要与RNA 聚合酶Ⅱ启动子对pri-miRNA 转录的调控（regulation of pri-miRNA transcription from RNA polymerase Ⅱpromoter）、血管内皮生长因子受体信号通路（vascular endothelial growth factor receptor signaling pathway）、二十醛代谢过程（icosanoid metabolic process）、受体生物合成的过程（receptor biosynthetic process）等生物过程密切相关，见图3及表5。分子功能（molecular function）分析结果显示枸杞子干预AD主要与RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性，配体激活的序列特异性DNA 结合（RNA polymerase Ⅱ transcription factor activity，ligandactivated sequence-specific DNA binding）分子功能密切相关，见图4及表6。通路（pathways）分析结果显示，枸杞子干预AD 参与通路有花生四烯酸代谢（arachidonic acid metabolism）、核受体转录途径（nuclear receptor transcription pathway），见 图 5及表7。

图3 枸杞子干预AD关键靶点Biological Process分析

表5 枸杞子干预AD关键靶点Biological Process分析参与基因

图4 枸杞子干预AD关键靶点Molecular Function分析

表6 枸杞子干预AD关键靶点Molecular Function分析参与基因

图5 枸杞子干预AD关键靶点Pathways分析

表7 枸杞子干预AD关键靶点Pathways分析参与基因

3 讨 论

本研究基于网络药理学探讨枸杞子干预AD的作用网络，预测作用机制。结果表明，枸杞子干预AD的主要活性成分有槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等；PTPN1、AR、CYP19A1、ACHE、HSD11B1等关键靶点的ClueGO 及Pathways 分析结果显示，枸杞子干预AD 主要与RNA 聚合酶Ⅱ启动子对pri-miRNA 转录的调控、血管内皮生长因子受体信号通路等生物过程密切相关；与RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性，配体激活的序列特异性DNA结合的分子功能密切相关；参与通路有花生四烯酸代谢途径和核受体转录途径。

研究表明，槲皮素可以保护Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤［11］，可通过增加Aβ 清除和减少星形胶质细胞增生，改善AD 疾病发展早中期的认知功能障碍［12］。Ye 等［13］研究发现，β-谷甾醇具有改善 APP/PS1 小鼠的记忆和学习障碍，减少Aβ 沉积的作用。Shi等［14］研究发现，β-谷甾醇可能通过维持膜胆固醇稳态来抑制高胆固醇诱导的Aβ 释放，而膳食植物甾醇具有穿透BBB的潜力，因此，植物甾醇（如β-谷甾醇）可能有助于 AD 预防。Brimson 等［15］研究发现，豆甾醇、β-谷甾醇和羽扇豆醇作为鼻棘鱼提取物可能在保护HT-22小鼠海马细胞免受谷氨酸毒性方面发挥作用，但在β-淀粉样蛋白神经毒性的保护方面是否有作用尚不清楚。

于建平等［16］报道，AD 患者的VEGF表达水平显著低于健康体检者，认知功能或记忆功能障碍较为严重的AD患者其VEGF 的表达水平更低。然而对于结果中所提到的RNA聚合酶Ⅱ转录因子，目前没有研究，而AD 发病机制是否涉及到RNA 聚合酶Ⅱ转录因子仍待探索。

花生四烯酸是人体心脑血管中的多种重要活性物质的前体，环氧化酶、脂氧合酶、细胞色素P450 系是花生四烯酸代谢的三种途径，是产生炎症介质的主要途径［17］。有文献报道，AD 的发病机制除了淀粉样蛋白假说外，免疫炎症、APP 代谢、Aβ 的加工（产生、聚集和清除）、胆固醇代谢、细胞周期等也与AD 相关［18］。对于所得结果中的核受体转录途径需要进一步地进行验证及探索。

本研究运用网络药理学的研究方法，对枸杞子干预AD 进行了系统的分析，初步得到枸杞子干预AD的潜在活性成分、参与基因及作用机制，为进一步探讨有效的活性成分及作用机制提供了方向，其后仍需对其进行相关实验验证。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突