微塑料与铅复合污染对水稻幼苗根系生长和氧化应激的影响

刘玲，洪婷婷，胡倩男，谢瑞丽，周颖，王玲，汪承润*

（1.淮南师范学院生物工程学院，安徽 淮南 232038；2.资源与环境生物技术安徽普通高校重点实验室，安徽 淮南 232038）

20 世纪50 年代以来，全球工业等领域实现了大规模生产，塑料产量迅速增加[1]。然而，塑料再利用率低，多数被丢弃至环境中，因物理化学作用，较大塑料被降解成粒径小于5 mm的颗粒、碎片，形成微塑料（MPs）[2]。近年来，MPs 被认为是一种新型污染物[3]，其在海洋、河流、土壤等生态系统中皆已被发现[4−6]，MPs的大小[7]、特性[8]和丰度[9]等已得到研究。据统计，大量的设施农业生产导致了土壤中MPs含量剧增，土壤生态系统中MPs 已远超海洋[10−11]，MPs 对土壤性质和土壤生物生长的影响引起了广泛关注。前人研究显示，MPs 改变了农田的结构及性质，阻碍土壤中养分运输，进而对生物多样性产生一定负面影响[12−14]。另外，由于MPs 粒径小，易被滤食性动物[15]、环节动物[16−17]及鸟类[18]误食，进一步通过食物链传递、富集到更高级生物体，引起机体器官堵塞或机械损伤及免疫系统功能受损甚至死亡[19]，影响动物的生长、繁殖等[20]，此外，MPs 对植物也有一定损伤作用。LAGARDE 等[21]指出，MPs 可与微藻、胞外多糖组成异质聚集体，推测这种异质聚集体是MPs垂直运输的重要途径，进而诱导微藻、衣藻毒性。SJOLLEMA 等[22]的研究表明，MPs 可降低藻类的光合作用。MPs 不仅对低等植物产生影响，当其对土壤功能产生扰动时，高等植物的生长生理特性可能也会随之受到影响。连加攀等[23]的研究指出，MPs 减少了小麦对营养元素的吸收量，影响能量代谢的调节，降低了小麦的芽根生物量比。此外，李连祯等[24]指出，MPs既可被植物根部吸收进入维管组织进而到达地上器官，又可通过土壤−植物系统对植物生长表现出毒性效应。JIANG等[25]的研究显示，MPs 在蚕豆根系中的大量积累很可能会阻止胞间连丝运输营养物质而对其造成氧化损伤。因此，MPs对农田生态系统中的生产者构成了潜在威胁。

农田土壤中的污染物除MPs 外，还存在重金属等。Pb 是当前土壤环境中污染情况较为严重的一类重金属，在以土壤为生存环境的部分农作物（蕹菜、茄子、小白菜）中含量超标[26]。未处理的工业废水和污水处理厂的沉积物用于土壤灌溉、肥料可导致作物的生长环境中MPs大量存在[27−28]，所以Pb与MPs的共存不可避免。MPs具有高疏水性和较高的比表面积，易吸附有机及重金属污染物，已有大量研究证明MPs对Pb 有吸附作用[29−30]，且不同浓度的MPs 与Pb 会产生协同或拮抗作用[31]。目前，关于单一MPs 在植物体内的迁移及其对植物生长、氧化应激的影响有一定的研究[32−33]，但是，不同浓度的MPs 与重金属复合胁迫下作物生长及氧化应激能力变化的研究较少。因此，本研究利用主要粮食作物水稻作为供试材料，揭示其幼苗暴露于MPs 单一或与Pb 复合胁迫环境下生长生理特性的变化规律，并深入探究MPs 与Pb 产生效应的机理，旨在为MPs生态风险评估提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试水稻为徽两优9810，购于安徽荃银高科种业股份有限公司。聚苯乙烯荧光微球（Fluorescent poly⁃styrene microspheres，PS−MPs）购自天津大鹅科技有限公司。用透射电子显微镜（TEM，Jeol 2100F，日本Jeol公司）表征微塑料的形貌（图1），粒径为（100±4.47）nm。

1.2 储备液制备

Pb2+母液：称量0.66 g Pb（NO3）2，用去离子水溶解，定容至100 mL，制成20µmol·mL−1的Pb离子溶液。

PS−MPs 母液：量取10 mg·mL−1PS−MPs 30 mL，用适量的去离子水溶解，使用超声破碎仪（SCIENTZ JY92−Ⅱ，宁波新芝生物科技股份有限公司）振荡3 min，最后定容至60 mL，制成5 mg·mL−1PS−MPs 母液备用。

1.3 试验设计

选择大小均匀、无损伤、饱满的水稻种子，清水浸泡24 h 后转移至恒温水浴锅（35 ℃），待种子萌发后移至铺有潮湿纱布的托盘中，置于人工气候培养箱内（QHX−250 BS−Ⅲ，上海新苗医疗器械制造有限公司）培养，日温/夜温为30 ℃/25 ℃，光照/黑暗为14 h/10 h，相对湿度为80%。待幼苗长出3 片真叶后，挑选长势良好且株高相近的植株定植于装有1/4 Hoagland营养液[34]的培养盒（34.7 cm×24.8 cm×9.4 cm），在人工气候室内进行处理和培养，日温/夜温为28 ℃/25 ℃，光照/黑暗为15 h/9 h，每盒48 株。试验设置的8 个处理：不添加PS−MPs 和Pb（CK）、10 mg·L−1PS−MPs（T1）、20 mg·L−1PS−MPs（T2）、40 mg·L−1PS−MPs（T3）、20 µmol·L−1Pb（T4）、10 mg·L−1PS−MPs+20µmol·L−1Pb（T5）、20 mg·L−1PS−MPs+20µmol·L−1Pb（T6）、40 mg·L−1PS−MPs+20 µmol·L−1Pb（T7），每个处理重复3 次。每周更换一次水稻处理液（优化Hoagland营养液+各处理试剂），每2 d用加氧泵通气，21 d 后测量各项生长生理指标。PS−MPs、Pb 浓度设定分别参照李连祯等[24]、WANG等[34]的研究。

1.4 样品采集与处理

于每培养盒随机取出10 株幼苗（每盒取样位置相同），用清水冲洗、擦干后剪去茎叶部分。

1.5 测定项目与方法

1.5.1 生长指标测定

用直尺（精确到0.1 cm）测根长；运用分析天平（AX224ZH/E，常州奥豪斯仪器有限公司，精确度为0.001 g）测根鲜质量；将水稻根置于105 ℃烘箱（上海福玛实验设备有限公司）中杀青0.5 h 后在80 ℃下烘干至恒质量，测干质量。

1.5.2 抗氧化酶活性测定

过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚比色法[35]测定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法[35]测定；抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化氢酶（CAT）活性采用紫外吸收法[36]测定。

1.5.3 抗氧化同工酶电泳图谱

利用聚丙烯酰胺凝胶技术进行电泳[37]，设置电泳仪（DYY−6D，北京六一生物科技有限公司）的稳定电压为135 V，于冰浴中电泳3～4 h 后，当指示染料下行至距胶板末端1～2 cm 时停止电泳。采用氮蓝四唑法[38]、乙酸−联苯胺法[38]、淀粉法[38]分别对SOD、POD、CAT泳带染色，APX同工酶染色采用邵巍等[39]的方法。

1.5.4 氧化损伤指标测定

丙二醛含量采用硫代巴比妥酸显色法[40]测定；超氧自由基（）产生速率采用羟胺法[41]测定；根细胞死亡检测采用伊文斯蓝染色法[42]，后用光学显微镜（OLYM⁃PUSCX23，奥林巴斯工业有限公司）观察并拍照。

1.5.5 样品消解和Pb含量测定

采用硝酸−高氯酸（4∶1）消解水稻幼苗根系[43]。利用石墨炉法检测（原子吸收光谱仪：novAA 400P，德国Analytik Jen 公司），标准样为GBW（E）080119，灰化、原子化温度分别为300、1 400 ℃。

1.6 数据处理

运用Excel 2016、SPSS 17.0 软件进行数据统计和单因素方差分析，数据为平均值±标准偏差，经Dun⁃can 法对各处理间的差异性进行多重比较，利用Pho⁃toshop 软件对同工酶图谱进行灰度分析。使用Origin 2018软件对统计结果做图。

2 结果与分析

2.1 PS−MPs和Pb胁迫对水稻幼苗根系生长的影响

由表1 可知，水稻幼苗经10、20、40 mg·L−1PS−MPs 单一处理后，每株幼苗根系鲜质量、干质量显著低于对照，20 mg·L−1PS−MPs 处理幼苗的根长与对照差异较小（P＞0.05），40 mg·L−1PS−MPs 处理的3 个生长指标皆是最低，表明10～40 mg·L−1PS−MPs 对水稻幼苗的生长有一定的抑制作用，20 mg·L−1PS−MPs 抑制作用较低，而40 mg·L−1PS−MPs抑制作用最强。Pb单一处理下，水稻幼苗鲜质量、干质量、根长较对照分别显著降低26.6%、44.8%、36.7%；10、20 mg·L−1PS−MPs 复合Pb 处理下，水稻幼苗根长与生物量（干质量与鲜质量）皆高于Pb 单一处理，当PS−MPs 质量浓度达40 mg·L−1时，鲜质量与根长低于Pb单一处理，可见低质量浓度（10、20 mg·L−1）PS−MPs 减轻了Pb 对水稻根系生长的抑制，高质量浓度PS−MPs 则起到了加剧作用，产生低促高抑的现象。此外，PS−MPs 复合Pb处理生长指标均低于PS−MPs 单一处理，表明Pb 与PS−MPs的复合污染对水稻根系生长的抑制具有协同效应。

2.2 PS−MPs 和Pb 胁迫对水稻幼苗根系SOD、POD、APX、CAT活性的影响

如图2（A）所示，PS−MPs 单一处理水稻幼苗根系SOD 活性均高于对照，并随着PS−MPs 质量浓度的增加呈先上升后下降的趋势。10 mg·L−1PS−MPs 胁迫下，SOD 活性与对照处理接近，在20 mg·L−1PS−MPs处理水稻幼苗时，根系SOD 活性显著增加，高达7.3 U·mg−1（以单位蛋白计，下同），是对照的1.3 倍，而当PS−MPs 质量浓度增加至40 mg·L−1时，酶活性又逐渐恢复至对照水平，说明20 mg·L−1PS−MPs较大程度提高了SOD 活性；Pb 单一处理水稻幼苗根系SOD 活性达到最大，为8.3 U·mg−1，是对照的1.4 倍；PS−MPs 复合Pb 各处理水稻根系SOD 活性较Pb 单一处理分别显著降低了21.6%、9.1%、12.3%，可见二者复合污染中和了Pb 单一污染所引起的SOD 活性的增高，其中以低质量浓度（10 mg·L−1）PS−MPs 最为显著。10、20 mg·L−1PS−MPs 复合处理与相应的PS−MPs 单一处理相比无显著性差异，40 mg·L−1PS−MPs 复合处理SOD活性较该质量浓度PS−MPs单一处理则显著提高。

由图2（B）可知，与对照相比，PS−MPs 单一处理POD 活性整体下降，变化趋势与SOD 活性相似，且各处理之间无显著差异；Pb 单一处理水稻幼苗根系POD 活性降至最低，为7.4 U·mg−1，较对照显著降低32.0%；10 mg·L−1PS−MPs 复合Pb 处理使POD 活性升至最高，为11.4 U·mg−1，是对照的1.1 倍，与10 mg·L−1PS−MPs复合处理相比，20、40 mg·L−1PS−MPs复合Pb处理抑制了水稻根系POD 活性的升高，恢复至Pb 单一处理水平。

图2（C）表明，PS−MPs 单一处理APX 活性呈先下降后上升的趋势，各质量浓度处理较对照相比均显著增高了APX 活性，分别上升了42.2%、23.1%、57.0%，且在20 mg·L−1时达到最低，为9.3 U·mg−1，是对照的1.2 倍，40 mg·L−1时达到最高，为11.9 U·mg−1，是对照的1.6 倍；Pb 单一处理较对照显著提高了42.2%；10、40 mg·L−1PS−MPs 复合处理APX 活性较Pb 单一处理分别显著上升17.9%、28.4%，说明10、40 mg·L−1PS−MPs的存在升高了APX 活性，而20 mg·L−1PS−MPs 复合处理接近Pb单一处理水平。复合处理APX活性均高于对应的PS−MPs单一处理。

图2（D）显示，10、20 mg·L−1PS−MPs 单一处理的CAT 活性分别较对照显著增高，20 mg·L−1时达到最高，为25.0 U·mg−1，是对照的2.2 倍；Pb 单一处理较对照显著增高84.8%；复合处理随PS−MPs 质量浓度升高呈缓慢下降趋势，40 mg·L−1PS−MPs复合处理与Pb单一处理有显著差异，显示出高质量浓度PS−MPs 抑制了Pb 单一胁迫所引起的水稻根系CAT 活性的升高，即高质量浓度PS−MPs和Pb的复合污染对CAT活性的影响也存在中和效应。

2.3 PS−MPs和Pb胁迫下水稻幼苗根系同工酶图谱及灰度分析

图3 显示，4 种抗氧化酶同工酶图谱在各处理下变化不尽相同。SOD 同工酶图谱均显示3 条酶带；POD 同工酶图谱在单一Pb处理及复合处理中表达了3条酶带，其他处理只有2条酶带；APX 同工酶图谱与CAT 同工酶图谱均只出现了1 条酶带。PS−MPs 单一处理较对照相比诱导了POD 同工酶图谱带型光密度的减少、总灰度值的降低（图4）；Pb 单一及复合处理较对照处理均诱导了POD 同工酶图谱带型数量的增多和带型光密度的变化。Pb 单一处理的总灰度值降至最低；10 mg·L−1PS−MPs复合处理与Pb单一处理相比带型数量和带型光密度明显增加，且总灰度值升高，20、40 mg·L−1PS−MPs 复合处理较对照诱导了带型光密度显著减少，总灰度值降低。各处理的同工酶带型光密度（图3）、同工酶图谱灰度分析（图4）与酶活性（图2）变化趋势基本一致。

2.4 PS−MPs和Pb胁迫对水稻幼苗根系氧化损伤的影响

如图5所示，3个PS−MPs单一处理水稻根系丙二醛含量与超氧自由基产生速率呈上升趋势，各处理MDA 含量分别较对照显著增高26.0%、35.0%、41.2%，但处理间未达到显著水平，各处理超氧自由基产生速率分别较对照显著增高34.5%、41.9%、60.2%，表明水稻在PS−MPs 单一胁迫下均受到严重损伤；Pb 单一处理MDA 含量与产生速率均升至最高，为12.7 nmol·g−1（以鲜质量计，下同）和5.7 nmol·min−1·mg−1，分别是对照的1.7、2.0 倍；PS−MPs 复合处理与Pb单一处理相比，MDA含量与产生速率有先降低再升高的趋势，复合处理中随着PS−MPs 质量浓度增加，MDA含量与产生速率逐渐升高，至40 mg·L−1时变化显著，分别达到13.2 nmol·g−1、5.9 nmol·min−1·mg−1，是对照的1.8 倍与2.1 倍，超过Pb、PS−MPs单一处理水平，说明高质量浓度（40 mg·L−1）PS−MPs复合Pb处理加重了水稻幼苗生活环境的胁迫程度，PS−MPs与Pb对幼苗根系损伤表现为协同性。

2.5 根细胞死亡检测

如图6 所示，水稻幼苗根尖细胞染色在CK 组最浅，细胞死亡较少，能够正常地进行细胞代谢活动。PS−MPs 单一处理与10、20 mg·L−1PS−MPs 复合Pb 处理下幼苗根尖染色较深。Pb 单一处理与40 mg·L−1PS−MPs 复合处理下染色最深，即细胞死亡情况最为严重。而与Pb 单一处理相比，PS−MPs 与Pb 联合处理水稻根尖染色由浅变深，可见，低质量浓度PS−MPs减轻了Pb 对水稻根系的损伤，高质量浓度的PS−MPs则加重了Pb对水稻根系的损伤。

2.6 PS−MPs和Pb胁迫对水稻幼苗根系Pb含量的影响

表2 显示，PS−MPs 复合Pb 胁迫下，当PS−MPs 质量浓度为10、20 mg·L−1时，根中Pb 含量均显著低于Pb 处理，分别较Pb 单一处理降低了23.2%、24.7%；在40 mg·L−1PS−MPs处理下，水稻根系的Pb含量增加到最大，为93.1µg·g−1，是Pb 单一处理的1.1 倍。可见，10、20 mg·L−1PS−MPs 的存在降低了水稻根系中的Pb含量，而更高质量浓度（40 mg·L−1）PS−MPs 显著增加了Pb在水稻根系中的积累量。

表2 PS−MPs复合Pb胁迫对水稻幼苗根系铅含量的影响Table 2 Effects of PS−MPs combined with Pb on lead content in rice seedlings root

3 讨论

3.1 PS−MPs和Pb胁迫对水稻根系生长的影响

已有研究表明MPs 会对动物产生不可逆的生理毒害，PAUL−PONT 等[44]指出其可直接诱导海洋贻贝组织、细胞和分子的毒性，影响动物体的生长繁殖。此外，MPs 对植物的生长也有抑制作用。吴佳妮等[45]研究了100 nm PS−NPs 在0、50、100、200、500、1 000 mg·L−1质量浓度梯度下对大豆幼苗生长的影响，发现在200 mg·L−1时，其对幼苗产生的抑制作用最强，根系干质量较对照降低17.1%，根长降低20.0%。本研究使用的PS−MPs 质量浓度（10、20、40 mg·L−1）虽较低，但单一处理水稻幼苗后，也不同程度地抑制了水稻根系生长，表现为随着PS−MPs 质量浓度的增高，根系干质量较对照分别降低了16.3%、10.1%、22.8%，根长分别降低了20.3%、6.7%、14.6%，且在中等浓度下（20 mg·L−1）抑制作用最弱。推测MPs 对植物生长的抑制效应除了与质量浓度有关[46]，还与其粒径、植物抗性等因素有关，尤其MPs粒径可能会影响生物体对MPs的吸收和吸附，小粒径（20、50 nm）的微塑料对植物生长影响更大，体现在微塑料对植物的附着力变大和胞外聚合物的重排[47]。水稻幼苗除了吸附MPs，也吸收重金属。水稻根部与Pb 最先接触，积累了较多Pb 且不易转移，成为对Pb 污染最敏感部位[48]。AKHTAR 等[49]的研究显示，高质量浓度Pb（500 mg·L−1）胁迫对水稻根系生长具有明显的抑制作用，其中根长、干质量及鲜质量较对照分别降低了18.5%、21.1%、30.9%。

本研究发现在20 µmol·L−1（4.1 mg·L−1）Pb 处理下，水稻（徽两优9810）根系根长、干质量及鲜质量较对照均显著降低，分别降低26.6%、44.8%、36.7%，表明20µmol·L−1Pb较大程度地抑制了该水稻根系的生长，推测是根部细胞被严重损伤[50]。DONG 等[51]的研究指出重金属与不同质量浓度的PS−MPs 复合会对水稻产生不同的效应，较低质量浓度（40 mg·L−1）PS−MPs能有效减弱重金属对水稻生长的抑制，从而较单一重金属处理促进了植物生长，高质量浓度（200 mg·L−1）PS−MPs 则加重了重金属对水稻生长的毒害。本试验研究结果与前人结论基本一致，10、20 mg·L−1PS−MPs 复合处理下水稻幼苗生长量高于单一Pb 处理，40 mg·L−1下根长及鲜质量低于单一Pb处理，表明低质量浓度（10 mg·L−1）PS−MPs 复合处理缓解了Pb对水稻幼苗根系生长的毒害，高质量浓度（40 mg·L−1）PS−MPs 与Pb 复合则加剧了毒害，对水稻根系生长有明显的抑制作用，主要可能是引起了细胞的氧化应激反应，导致细胞内的ROS 含量增加，防御系统平衡被打破[51]。

3.2 PS−MPs和Pb胁迫对水稻根系氧化损伤的影响

3.3 PS−MPs和Pb胁迫对水稻根系抗氧化酶活性的影响

植物可通过体内的几种抗氧化酶活性来应对外界胁迫，多种抗氧化酶通过协同作用使植物体内的自由基含量保持动态平衡的状态，防止自由基过多对植物生长生理造成损伤，从而缓解外界环境对植物的毒害效应，但是当胁迫下ROS 过量积累时会通过破坏抗氧化酶的表达系统和结构，造成酶活性降低[59−60]。ZHAO 等[61]测定了水稻、大豆等作物在应对胁迫时的各项生理指标，发现抗氧化酶活性等参数比其他生理指标（如色素和总蛋白含量）更敏感，能作为有效检测植物对胁迫响应的指标。本试验中单一PS−MPs 处理除POD 活性低于对照以外，其他酶活性均整体高于对照，说明水稻对胁迫有一定的耐受性，各PS−MPs处理下酶活性的短暂升高是机体为免受外界胁迫而产生的调节反应，酶活性降低则表示ROS 大量消耗了抗氧化酶，且ROS 积累超出酶调节能力的阈值[62]。在低质量浓度（10 mg·L−1）PS−MPs 胁迫条件下，水稻通过SOD、APX、CAT 活性增加来中和产生的ROS，使机体免受MPs的毒害。张晨等[63]探究PS−MPs对黑藻酶活性的影响时也发现，在低质量浓度（5 mg·L−1）PS−MPs 胁迫条件下，黑藻会通过增高酶活性来使其生理生化作用免受PS−MPs的影响。而廖苑辰等[62]研究了PS−MPs（0～100 mg·kg−1）处理小麦后抗氧化酶活性的变化，其中SOD 活性始终低于对照，CAT 活性呈先降低后升高的趋势，这与本研究结果不太一致，可能是植物种类与PS−MPs 处理浓度不同所导致的[64]。本试验测定的SOD、CAT、APX 活性在单一Pb 胁迫时较对照均显著增高，而POD 活性较对照低。ASHRAF等[56]在研究Pb 胁迫对水稻生理影响时也发现水稻通过改变SOD、CAT、APX、POD活性来抵抗Pb胁迫。苑文珂[31]研究重金属在大型溞体内的积累量的结果显示低质量浓度（0.01～10 mg·L−1）PS−MPs 能够减少重金属在大型溞体内的积累量，而高质量浓度（10～1 000 mg·L−1）PS−MPs 导致重金属在大型溞体内较大程度的积累，随着MPs 质量浓度的增加，重金属和MPs的复合效应从拮抗作用转变为加成作用，显示低促高抑的效应。WANG 等[65]也表明一定质量浓度（1 mg·L−1）的MPs 与Pb 的结合对微囊藻会显示协同作用。本研究中，低质量浓度（10 mg·L−1）PS−MPs 复合Pb 处理下4 种酶表现不尽相同，其SOD、CAT 活性较Pb 处理降低，可能是由于低质量浓度PS−MPs 减缓了水稻根系对Pb 的吸收而减轻毒害，使SOD、CAT 活性降低，而POD、APX 活性升高可能是在过量消耗后因损伤减轻而逐渐恢复其活性。高质量浓度（40 mg·L−1）PS−MPs 复合处理较低质量浓度复合处理相比有更大的危害，表现在酶活性显著上升或抗氧化酶遭到损伤而导致活性大幅下降。推测可能是由于高质量浓度PS−MPs吸附、运载大量Pb到水稻体内而造成重金属在水稻体内的大量积累[31]。

4 结论

（1）PS−MPs 或Pb 单一污染对水稻根系生长、氧化应激均显示一定的危害性，且PS−MPs 的质量浓度与水稻根系的损伤有相关性。

（2）20µmol·L−1Pb对水稻根系生长、丙二醛和超氧自由基的产生及对POD、SOD活性的抑制作用均强于单一PS−MPs胁迫。

（3）低质量浓度PS−MPs（10 mg·L−1）的存在占据Pb在根部的吸附位点进而减轻了Pb对水稻根系的毒性效应，表现为拮抗作用；高质量浓度PS−MPs（40 mg·L−1）将更多的重金属运输到水稻体内组织并积累而产生协同作用。