钙对乡土树种白枪杆光合特性和荧光参数的影响*

段华超，李燕燕，叶 澜，井卉竹，李世民，董 琼

（西南林业大学，西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，云南 昆明 650224）

光合作用是植物维持正常生命活动的最基本要求，也是植物对非生物胁迫最敏感的生理过程之一[1]。钙在植物的生长及生理过程中起着重要的作用[2]。钙作为“第二信使”，具备直接或间接参与物质传输、调控气孔保卫细胞的渗透势、调节气孔对环境中CO2的吸收、减少水分散失和提高水分利用效率的作用，进而增强光合作用[3-4]。叶绿素作为光合作用的主要色素，在植物光反应过程中起着十分重要的作用，其含量对光合效率有着决定性的作用。适量的钙可有效促进铁和镁元素的吸收，从而促进叶绿素合成；但钙过量会降低植物对铁和镁的吸收，抑制叶绿素合成，最终降低植物的光合效率[5-7]。叶绿素荧光参数能反映逆境胁迫下植物的光合生理特性，其信号因具有反应灵敏且迅速的特性而被广泛用作光合作用的光系统探针[8]。一定浓度的钙能有效保护PSⅡ活性，促进光合电子的传递速率，维持较高的净光合速率和胞间CO2浓度，对植物的生长产生积极作用[9-10]。目前，钙对植物光合特性的影响研究主要集中在逆境胁迫下钙的缓解调控作用[2,9-13]，但以钙为首要影响因子的植物光合特性研究较少。

白枪杆（Fraxinus malacophylla）属木犀科（Oleaceae）梣属（Fraxinus）双子叶植物，落叶小乔木，耐旱，耐瘠薄，抗逆性和发芽力强[14-16]；主要分布于滇东南山原峡谷常绿阔叶林中，多为阔叶伴生树种，也是该地区生态恢复常用树种之一，具有很高的药用和生态价值[17-18]。近年来，随着国家生态文明建设发展战略的提出，西南岩溶石漠化地区生态恢复取得了显著成果，白枪杆作为主要乡土树种之一，也被广泛用于石漠化生态恢复。但在生态恢复过程中，白枪杆面临着干旱和富钙等生境问题[19-20]，而有关其对土壤中钙元素的响应和调控机制尚未见文献报道。因此，本研究以白枪杆幼苗为对象，针对西南岩溶石漠化地区土壤钙含量富积的环境条件，探究钙对白枪杆生长及光合作用的调节机制，明确适宜白枪杆生长的钙浓度，为白枪杆的推广利用提供技术支撑，也为岩溶石漠化地区植被恢复及生态文明建设可持续发展提供更多理论参考，并进一步丰富钙对植物光合特性影响的理论研究。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于西南林业大学格林温室（云南省昆明市，N25°03′，E102°45′），地处亚热带高原季风气候区，海拔1 904 m；霜期短，气候温和，年平均温度16.5 ℃，最低月平均气温12.9 ℃（12 月），最高月平均气温28.4 ℃（6 月），年平均降水量1 035 mm，主要集中在6—10 月，年平均相对湿度67%（数据来源于国家气象科学数据中心）。

1.2 试验材料与试验设计

供试材料为一年生白枪杆实生袋苗，2020 年1 月播种于云南建水。2020 年6 月由云南建水运往西南林业大学格林温室，并植入营养钵中。营养钵上口径160 mm，下口径110 mm，高120 mm，底部垫托盘；盆栽土壤理化性质为：pH 5.45，总氮含量0.71 g/kg，总磷含量0.57 g/kg，总钾含量2.06 g/kg，总钙含量0.48 g/kg，镁含量0.12 g/kg，铁含量60.99 g/kg，容重1.14 g/cm3；基质配比为m红壤∶m河沙∶m珍珠岩=5∶3∶2，每盆种植1 株幼苗，于温室内进行常规管理。适应生长15 d 后，于7 月5 日选取长势均匀一致的苗木，用于CaCl2浇灌处理。

试验采用单因素完全随机试验设计，根据前期预试验，设置0（CK）、25（低钙）、50（中钙）和75 mmol/L（高钙）4 个钙浓度梯度，分别记为CK、T1、T2和T3，每隔15 d 分别用不同浓度CaCl2溶液对白枪杆幼苗进行定量（每株50 mL）浇灌，CK 以等量的去离子水灌溉。每个处理18 株，4 次重复，共288 株。浇灌过程中将渗入托盘的溶液倒回营养钵中，防止钙流失。每隔15 d 测定1 次生长指标；钙处理90 d 后，测定光合指标和叶绿素荧光参数，并从每株相同位置采2～3 片叶保存于液氮，在实验室测定叶绿素含量。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生长指标测定

测定的生长指标包括幼苗的株高、地径和株幅。钙处理试验开始时，于生长期内每隔15 d 利用钢尺（精确度0.01 cm）和游标卡尺（精确度0.02 mm）准确测量幼苗株高、地径（东西、南北方向的平均值）和株幅（长、短株幅的平均值）。幼苗株高、地径和株幅的生长量分别为试验结束和试验开始时的数值之差。

1.3.2 光合指标测定

于2020 年10 月上旬选择晴朗无云的连续3 d，采用Li-6400XT 便携式光合测定仪（LI-COR公司，美国）从8：0 0—18：0 0 测定从顶芽往下数第4～6 片完整功能叶的光合日变化，间隔2 h测定1 次。每个处理选取4 株长势基本一致的幼苗，每株测定2 片叶，每片叶重复测定3 次（每次读取10 个数值），结果取平均值。同时期于晴天上午9：3 0—11：3 0 测定其光合特性，测定指标包括白枪杆幼苗功能叶的净光合速率（photosynthetic rate，Pn）、气孔导度（stomatal conductance，Gs）、胞间CO2浓度（intercellular CO2concentration，Ci）和蒸腾速率（transpiration rate，Tr）。测定时采用自然光源，标准叶室（2 cm×3 cm），空气流速为500 s/m3，并计算水分利用率（water use efficiency，WUE）：WUE=Pn/Tr。

1.3.3 叶绿素荧光参数测定

叶绿素荧光参数的测定与光合参数测定同步进行，每个处理挑选4 株长势一致的幼苗，每株选取第4～6 片中无病虫害、长势良好、功能完整的2 片叶进行标记。采用PEA-Plus 高速连续激发式荧光仪（Hansatech 公司，英国）测定叶绿素荧光参数，测定前充分光适应，再进行暗处理30 min，测定初始荧光产量（initial fluorescence yield，Fo）、最大荧光产量（maximal fluorescence yield，Fm）、PSⅡ最大量子产率（Fv/Fm）和PSⅡ潜在活性（Fv/Fo），每片叶测定3 次，连续测定3 d，取平均值。

1.3.4 叶绿素含量测定

采用分光光度法测定叶绿素含量。将采集的新鲜叶片去除叶脉剪碎混匀，准确称取0.2 g（精确度0.001 g），放入干燥研钵中，加入液氮快速研磨至粉末状。先后加入95% 乙醇3 和5 mL，继续研磨成匀浆状后静置3～5 min，将匀浆全部移入25 mL 棕色容量瓶中，并用95% 乙醇定容，摇匀后静置12 h[21]。以95%乙醇为空白对照，利用紫外分光光度计于波长665、649 和470 nm下测定叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）和类胡萝卜素（Car）的吸光度（OD 值），按照公式[22]计算每克叶片的叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素含量。每个样品重复3 次，取平均值。

式中：Ca、Cb和Cc分别为叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素的质量浓度（mg/L），OD665、OD649和OD470分别为波长665、649 和470 nm 下的吸光度。

再根据以下公式计算植物组织中叶绿素含量：

式中：C为色素质量浓度（mg/L），V为提取液体积（mL），N为稀释倍数，m为样品质量（g），1 000表示1 000 mL。

1.4 数据处理

使用Excel 2016 处理和统计数据；使用SPSS 25.0 进行单因素方差分析，各处理平均值采用LSD 法进行多重比较和差异显著性检验；使用Origin 2018 制图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度钙对白枪杆幼苗形态指标的影响

由表1 可知：在不同浓度钙处理下，白枪杆幼苗生长指标前15 d 内无显著差异（P＞0.05）；与CK 相比，钙处理30 d 后株幅开始出现显著差异（P＜0.05），处理45 d 后苗高开始出现显著差异（P＜0.05）；试验期间，不同浓度钙处理的地径均未出现差异（P＞0.05）。不同浓度钙处理下，苗高和株幅生长量差异较大，其生长量大小顺序均为T2＞T1＞T3＞CK，T2处理分别比CK 高15.07%和23.32%（P＜0.05）；地径生长量大小顺 序 为T2＞T1＞CK＞T3；但白枪杆幼苗各形态指标生长量均随钙浓度的增加呈先增加后下降的趋势。

表1 不同浓度钙处理下白枪杆幼苗生长指标测定结果Tab.1 Determination results of growth index of Fraxinus malacophylla seedlings under different calcium concentration treatments

2.2 不同浓度钙对白枪杆幼苗光合特性的影响

2.2.1 不同浓度钙对光合日变化的影响

由图1 可知：不同钙浓度处理下，白枪杆幼苗叶片在晴天净光合速率（Pn）和气孔导度（Gs）日变化趋势大致相同，T2的变化幅度最大，T3的变化幅度最小，且均呈明显的双峰曲线：从8：00开始上升，10：00—12：00达到第1 个高峰，然后快速下降，12：00—14：00降至“光合午休”状态；14：00—16：00开始缓慢上升并达到第2 个高峰，后缓慢下降，到16：00—18：00降到最低点。白枪杆幼苗叶片Pn日变化与Gs、蒸腾速率（Tr）呈正相关，与胞间CO2浓度（Ci）呈负相关。此外，不同浓度钙处理的Tr均小于CK。

图1 不同钙浓度对白枪杆幼苗叶片光合特性日变化的影响Fig.1 Effects of different calcium concentrations on the diurnal changes of photosynthetic characteristics of Fraxinus malacophylla seedling

2.2.2 不同浓度钙对光合参数的影响

由表2 可知：不同浓度钙处理下白枪杆幼苗功能叶Pn和Gs大小顺序均为T2＞T1＞CK＞T3，中浓度钙（T2）处理的Pn比其他处理显著提高10.68%～43.47%（P＜0.05），低浓度钙（T1）和中浓度钙（T2）处理的Gs显著高于对照和高浓度钙处理（P＜0.05）。由表2 还可知：T2处理的Ci值显著低于其他处理（P＜0.05）；不同浓度钙处理均可显著降低白枪杆幼苗的Tr（P＜0.05），降幅分别为 27.63%、25.57%和34.43%；不同浓度钙处理下，水分利用率（WUE）随着钙浓度的增加呈先升高后下降的趋势，T2处理的WUE 显著高于其他处理（P＜0.05）。

表2 不同浓度钙对白枪杆幼苗光合参数的影响Tab.2 Effects of different calcium concentrations on the photosynthetic parameters of F.malacophylla seedling

2.3 不同浓度钙对白枪杆幼苗叶片荧光参数的影响

由图2 可知：不同浓度钙处理后，白枪杆幼苗叶片初始荧光产量（Fo）呈先升高后降低的趋势；对照处理的Fo值最小，为410.33±20.26，中浓度钙处理（T2）的Fo最大，达467.67±13.79，比对照高13.97%（P＜0.05），表明中钙处理光合系统开放程度显著高于对照。随着钙浓度升高，最大荧光产量（Fm）呈先升后降的趋势；钙浓度达到50 mmol/L 时，Fm最大，显著高于对照，有效提高了PSⅡ电子传递速率；钙浓度达到75 mmol/L时，Fm显著小于对照，说明PSⅡ电子传递开始受阻，产生胁迫作用。由图2 还可知：PSⅡ最大量子产率（Fv/Fm）和潜在活性（Fv/Fo）随钙浓度的增加均呈先增加后降低的变化趋势，均在T2处理下达到最大值，分别为0.83±0.01 和4.95±0.03，显著高于对照（P＜0.05）；Fv/Fm和Fv/Fo在高浓度钙（T3）处理下均显著低于对照（P＜0.05），表明PSⅡ反应中心在高钙浓度下活性受抑制。

图2 不同浓度钙对白枪杆幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响Fig.2 Effects of different calcium concentrations on the chlorophyll fluorescence parameters of F.malacophylla seedling

2.4 不同浓度钙对白枪杆幼苗叶绿素含量的影响

由表3 可知：不同浓度钙对白枪杆幼苗叶片叶绿素含量有显著影响，表现为随钙浓度的增加，白枪杆幼苗叶片叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）、叶绿素总量[Chl（a+b）]和类胡萝卜素（Car）含量均呈先增加后减少的趋势。中浓度钙（T2）处理下，白枪杆幼苗叶片Chla、Chlb、Chl（a+b）和Car 含量均显著高于对照（P＜0.05），但Chla/Chlb与对照差异不显著（P＞0.05）；低浓度钙（T1）处理下，叶绿素各指标含量与对照均无显著差异（P＞0.05）；高浓度钙（T3）处理下，Chla/Chlb 与对照差异显著（P＜0.05），其余指标差异性均不显著（P＞0.05）。

表3 不同钙浓度对白枪杆幼苗叶绿素含量的影响Tab.3 Effects of different calcium concentrations on the chlorophyll content of F.malacophylla seedling

3 讨论

3.1 钙对叶绿素和光合特性的影响

钙与植物叶片的叶绿素含量密切相关。钙离子浓度变化可以影响植物对镁的吸收及分配，从而影响叶绿素合成[23-24]。有研究表明：适量外源钙添加可以促进植株生长发育和叶绿素合成，提高植株光合效率[25]；钙浓度过高会抑制植物对其他元素的吸收和利用，也抑制植物光合系统生理活性，从而使植株受到钙胁迫导致其生长发育缓慢[26]。叶绿素a/叶绿素b 主要反映PSⅡ聚光复合体在所有含叶绿素的结构中所占的比重，该值上升则PSⅡ聚光复合体含量减少，光合速率下降[27]。本研究中，低、中浓度钙处理下，白枪杆幼苗的生长量和叶绿素含量均呈上升趋势；而高浓度钙处理下，其生长量和叶绿素含量下降，叶绿素a/叶绿素b 上升，与孙悦[10]的研究结果相似。这说明适宜的钙浓度有利于白枪杆幼苗生长及叶绿素合成；钙浓度过高会产生胁迫作用，抑制其生长，降低叶片叶绿素含量和PSⅡ聚光复合体含量，从而降低光合效率。

钙元素对植物的光合作用具有重要作用，添加适量的外源钙可以提高植物的净光合速率（Pn），促进气孔打开，提高蒸腾速率（Tr）和水分利用率（WUE），进而促进植物幼苗光合作用[28-30]。本研究表明：低、中浓度钙（25 和50 mmol/L）处理下，白枪杆幼苗的Pn、气孔导度（Gs）和WUE均显著提高，胞间CO2浓度（Ci）降低，与任城帅等[13]的研究结果一致；但Tr比CK 显著下降，与苏志孟[31]的研究不一致，其原因可能是低、中浓度钙处理下WUE 显著提高，叶片中自由水含量降低，参与蒸腾的水分较少，从而导致其Tr小于对照。孙悦[10]和韩飞燕[30]分别以油松（Pinus tabuliformis）和麻栎（Quercus acutissima）为研究对象，发现钙浓度过高时，2 种植物的光合效率降低，植物生长受限；本研究中，高浓度钙（75 mmol/L）处理下白枪杆幼苗Pn、Gs和Tr均显著低于低、中浓度钙处理，各器官生长量降低，说明添加过量的外源钙会降低白枪杆幼苗的光合作用，抑制其生长。

3.2 钙对叶绿素荧光参数的影响

叶绿素荧光参数能有效表征植物的生长状态，是研究植物光合原初反应的无损探针，可监测光合作用的多个进程，并能体现植物的生理状况，是生境中物理及化学条件胁迫对植物生长影响的重要指标[32-33]。荧光参数中，初始荧光产量（Fo）反映的是光系统（PSⅡ）处于完全开放时的荧光产量，最大荧光产量（Fm）反映的是PSⅡ完全封闭时的荧光产量，Fv/Fm和Fv/Fo分别表示PSⅡ的最大量子产率和潜在活性，可以有效反映植物的光合发生情况[34-35]。王辉等[36]通过对玉簪（Hosta plantaginea）添加不同浓度外源钙溶液发现：添加适宜浓度的外源钙能有效提高玉簪荧光产量、最大光学效率和潜在活性；钙浓度过高则会抑制荧光产量，降低光能利用率。本研究中，不同浓度外源钙处理下白枪杆幼苗的Fo、Fm、Fv/Fm和Fv/Fo值均有较大变化。钙浓度达到75 mmol/L 时，Fv/Fm和Fv/Fo值均显著下降，说明钙浓度超过75 mmol/L 会产生胁迫作用，显著降低白枪杆幼苗PSⅡ最大量子产率和PSⅡ潜在活性，且Fo在钙胁迫作用发生后相比CK 增大，也充分反映了PSⅡ反应中心受抑制，与王辉等[36]的研究结果相似；而Fm明显降低，与谢诗[37]和王婧[38]的研究结果不一致，分析其原因可能是研究材料不同所致，白枪杆作为木本植物，对钙浓度变化更敏感，钙胁迫发生后，PSⅡ反应中心电子传递速率下降，导致Fm明显降低，但具体原因有待进一步研究。钙浓度为50 mmol/L 时，白枪杆幼苗的Fo、Fm、Fv/Fm和Fv/Fo值均显著高于对照，说明添加50 mmol/L 的外源钙能有效提高白枪杆PSⅡ反应中心荧光产量、最大光学效率和潜在活性，增强植株的光合作用。此外，中浓度钙处理的叶绿素含量最高，Fo值也最大，Fo随着叶绿素含量增加而增大的关系也说明添加中浓度外源钙能显著提高白枪杆幼苗光合效率[39-40]。

4 结论

白枪杆幼苗生长的较适外源钙浓度为50 mmol/L。添加适宜的外源钙能促进白枪杆幼苗叶片叶绿素合成，提高净光合速率、气孔导度和水分利用率，提高白枪杆幼苗的Fo、Fm、Fv/Fm和Fv/Fo等荧光参数，从而进一步促进植株光合作用和植物生长；钙浓度过高则会抑制光合作用和生长。