四君子汤治疗胃黏膜损伤的机制探究

孙玉婷，刘明晖，方 爽，王长宏*

（1.吉林大学中日联谊医院，长春 130033；2.中国人民解放军联勤保障部队第九六五医院，吉林 吉林 132011）

胃溃疡（gastric ulcer, GU）是消化系统常见疾病，其发病与病原体感染、非甾体类药物和心理因素等相关[1-2]。近来研究发现氧化应激参与了GU的形成，GU发生的高危因素中，如HP感染[3]、NSAIDs损伤[4]、乙醇破坏[5]，有ROS的产生参与。当体内的活性氧簇（ROS）的过度产生破坏细胞内源性氧化平衡后，就会发生氧化应激应答[6-7]。Keap1/Nrf2/ARE 是目前研究较热门的抗氧化信号通路之一，Nrf2是维持细胞内氧化平衡的重要转录因子，当机体受到大量ROS刺激时，Nrf2会与Keap1分离，游离状态下的Nrf2会进入到细胞核内，与抗氧化元件ARE结合，启动很多下游的抗氧化基因和解毒基因的激活转录，如血红素氧合酶-1（HO-1）、醌氧化还原酶-1（NQO1）等，从而发挥清除氧自由基、抑制细胞凋亡等作用，避免机体免到受氧化损伤[8-9]。因此我们可以通过调节氧化机制来改善治疗GU。

四君子汤出自宋代《太平惠民和剂局方》，由人参、茯苓、白术、炙甘草组成。在临床上治疗消化道溃疡（PU）、慢性胃炎、消化不良等疾病，在治疗安全性、降低西药副作用以及减少复发率方面[10-11]，都被证实有良好的效果。但四君子汤治疗GU是否可以通过激活Nrf2信号通路，调节氧化应激来达到治疗GU的效果尚不明确。本研究主要通过体外实验，利用乙醇诱导胃黏膜上皮细胞GES-1细胞氧化损伤，检测氧化调节因子Nrf2及其下游调控的HO1、NQO1的表达量，从而来探究SJZD保护胃黏膜的抗氧化作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

1）四君子汤：药物均经专家鉴定符合药典要求，按照人参12 g，茯苓12 g，白术12 g，炙甘草8 g，药物来源及药液制作方法参考如下[12]，制备母液浓度为1 g·mL-1，浓缩后配制含生药2 000 mg·mL-1、1 000 mg·mL-1、500 mg·mL-1、100 mg·mL-1、50 mg·mL-1药液备用。2）试剂：RPMI-1640培养基、胎牛血清购自赛默飞世尔科技有限公司；青霉素链霉素双抗、显影液、0.22 μm PVDF膜、RIPA细胞裂解液、蛋白酶抑制剂购自碧云天生物技术有限公司；SYBR®Premix Ex Taq™ II购自宝日医生物技术有限公司。3）试剂盒：CCK-8细胞活力检测试剂盒、活性氧检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、RNA抽提试剂盒（柱式）、cDNA合成试剂盒、BCA蛋白浓度试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。4）细胞系：人胃黏膜上皮细胞系GES-1购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 细胞培养

GES-1细胞用RPMI-1640培养基（含10%血清和1%双抗），培养在37 ℃，5%二氧化碳 的细胞培养箱中，定期用支原体检测试剂盒检测，确保无污染。

1.3 细胞活力检测

将GES-1细胞接种到96孔板（4×104/孔），分6个浓度梯度组及1个空白对照组，每组6个复孔。待细胞贴壁后，更换为100 μL浓度分别为2 000 mg·mL-1、1 000 mg·mL-1、500 mg·mL-1、100 mg·mL-1、50 mg·mL-1、0 mg·mL-1的 SJZD药物培养24 h，弃药物培养液，加入完全培养基100 μL，4 h后，每孔加入10 μL CCK工作液，再培养2 h后，检测各孔OD值，选择后续实验最适SJZD浓度。

细胞接种及分组同上，分别在0 mg·mL-1、500 mg·mL-1的 含SJZD药物培养基中24 h，加入100 μL 含 0%、1.0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%无水乙醇的培养基继续培养4 h。按照上述CCK-8试剂步骤检测，选择最佳无水乙醇浓度。

细胞生长抑制率：生长抑制率（%） = （对照组OD值－实验组OD值）÷（对照组OD值－空白孔OD值）×100%。

1.4 凋亡检测

将GES-1细胞接种到6孔板（1×105/孔），贴壁后，更换为含药物的培养基，24 min后，加入2 mL含0%或5%无水乙醇的培养基继续培养，继续培养4 h，收集细胞（含上清），按细胞凋亡检测试剂盒说明书进行凋亡染色并送流式分析。凋亡细胞定义为Annexin V阳性的细胞。

1.5 ROS流式检测

将1×105个GES-1细胞接种到6孔板，贴壁后，换含药物或PBS的培养基，24 h后，实验组加入含5%无水乙醇的培养基，继续培养4 h，收集细胞试剂盒按说明书进行ROS染色并送流式分析。

1.6 实时荧光定量PCR

细胞用药物处理24 h，用5%无水乙醇的培养基处理细胞，4 h后，按实际说明书操作，用RNA提取试剂盒提取RNA，并进行cDNA合成，随后将cDNA产物与指定引物和SYBR®Premix Ex Taq™ II进行实时荧光定量PCR反应。利用ΔCT值相对定量法分析实时荧光定量PCR结果。公式为：ΔCT对照=CT对照目标基因-CT对照内参基因；ΔCT样本= CT样本目标基因-CT样本内参基因；ΔΔCT=ΔCT样本-ΔCT对照；基因相对表达量= 2^-ΔΔCT。

1.7 Western Blot

细胞用药物处理24 h，用5%无水乙醇的培养基处理细胞，4 h后，收集细胞，加入5倍体积的RIPA细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂），在冰上裂解30 min。用BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度后，用SDS上样缓冲液与样本混合并在100℃加热10 min，随后进行SDS凝胶电泳，将蛋白转移至PVDF膜后进行封闭、一抗和二抗孵育后，用ECL显影液在显影仪下显影并拍照记录。

1.8 统计学方法

采用 SPSS 19.0 统计软件进行结果分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，并用t检验分析组间差异；计数数据以百分比（%）表示，并用χ2检验分析组间差异。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SJZD降低乙醇诱导GES-1细胞的凋亡和ROS含量

为进一步研究四君子汤保护急性胃黏膜损伤的机制，首先研究了不同浓度四君子汤和不同浓度的无水乙醇对GES-1细胞生长活力的影响（见表1、表2）。根据细胞的生长抑制情况，后续实验选择了最适浓度500 mg·L-1SJZD以及5%的无水乙醇。图1可以看出SJZD治疗组的凋亡水平明显低于模型组，但并达到至正常组水平。表3、表4可以看出，SJZD治疗组对比模型组显著降低了GES-1细胞的凋亡率（P＜0.05）以及细胞内ROS含量（P＜0.05），SJZD可抑制乙醇诱导下产生的GES-1细胞的凋亡水平和ROS强度。

表1 不同浓度SJZD对GES-1细胞活力的影响（n= 6）

表2 不同浓度无水乙醇下SJZD对GES-1细胞活力的影响（n= 6）

表3 SJZD对5%乙醇诱导GES-1细胞的细胞凋亡率的影响（n= 6）

表4 SJZD对5%乙醇诱导GES-1细胞的ROS的影响（n= 6）

图1 SJZD对5%乙醇诱导GES-1细胞的细胞凋亡率的影响

2.2 SJZD对GES-1细胞中Nrf2、HO-1、NQO1表达量的影响

Nrf2是重要的细胞应激反应基因，是目前已知的抗氧化系统中最重要的基因，其激活可提高细胞抵抗氧化损伤的能力[13]。图2所示，SJZD治疗组的Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白表达量对比模型组显著上升（P＜0.05），提示四君子汤可激活Nrf2信号通路。如表5所示，SJZD 治疗组细胞中Nrf2及其下游基因HO-1和NQO1的mRNA表达量均较模型组有显著上调（P＜0.05），有趣的是我们发现SJZD组中的3组基因的表达亦有所上调。Western Blot与RT-qPCR的结果一致，都表明在SJZD治疗组（5%无水乙醇与500 mg·L-1SZJD的药物培养），激活了Nrf2信号通路，增强了GES-1细胞的抗氧化反应能力，改善了细胞内的抗氧化环境，促进GES-1细胞生存。

表5 SJZD对Nrf2信号通路相关基因mRNA影响（n= 6）

图2 SJZD对Nrf2信号通路相关蛋白影响

2.3 ML385联合实验抑制了SJZD的保护作用

为了验证SJZD对GES-1细胞的保护作用是否依赖于Nrf2，我们用Nrf2选择性抑制剂ML385[14]与SJZD联合处理。结果如下：在5%的无水乙醇作用下，对比SJZD组，SJZD+ML385组的细胞生长活力（表6）明显受到了抑制（P＜0.05），细胞凋亡水平（表7、图3）明显上升（P＜0.05）和ROS水平（表8）显著增强（P＜0.05）。ML385可能通过抑制细胞内氧化应激通路Nrf2及其下游基因表达，从而消除了SJZD对GES-1细胞的保护作用。

图3 ML385抑制SJZD的抗凋亡作用

表6 ML385影响SJZD对无水乙醇损伤GES-1细胞活力的保护作用（n= 6）

表7 ML385抑制SJZD的抗凋亡作用（n= 6）

表8 ML385抑制SJZD的抗ROS作用（n= 6）

3 讨论

GU属于中医“痞满、胃脘痛”范畴，2017年中医消化道溃疡指南专家共识中指出[15]，根据其胃黏膜病理特点增加了“胃疡”一名。中医认为GU的发病与饮食、情志、久病、体虚等相关，致使脾胃运化失司，脾胃乃后天之本，脾胃虚弱会影响营养物质吸收，削弱其保护防御作用。SJZD作为补脾胃的第一方，现代研究证实可以发挥促进黏膜恢复[16]、抗炎[17]、抗氧化应激[18]等作用。有研究报道，SJZD可以改变胃黏膜黏蛋白含量、胃黏膜免疫细胞亚群等，从而恢复黏膜屏障功能[19]。王东旭等也报道SJZD可以通过影响多胺防治胃黏膜损伤[20]。

乙醇是诱发GU中较为常见的因素。通过乙醇诱发的溃疡与人胃黏膜损伤非常相似且重复性好[21]，已成为研究GU广泛使用的经典模型[22]。其机制是主要通过减弱胃黏膜上皮细胞氧化应激，增加ROS产生，破坏细胞内氧化平衡，诱导细胞凋亡[23]，而细胞的持续凋亡也会破坏胃黏膜的完整性，导致其功能的障碍。本研究结果显示，SJZD可以抑制乙醇诱导的GES-1细胞的凋亡和ROS产生，提高了抗氧化标记物Nrf2、HO-1、NQO1的表达，对GES-1细胞起到了保护作用。

在GU的发生研究中，胃黏膜上皮细胞的凋亡对胃溃疡发生和愈合具有重要作用[24-25]。本研究首次报道SJZD可以有效减少乙醇对GES-1细胞的生长抑制，降低乙醇诱导的GES-1细胞内的ROS水平和细胞凋亡率。Nrf2是细胞内主要的应激应答基因，其激活可以促进抗氧化相关基因的转录，增强细胞抗氧化反应能力，从而保护细胞免受损伤。本研究结果显示，乙醇处理后，细胞内Nrf2及其下游靶基因HO-1和NQO1均有较低程度的激活，这可能是细胞对乙醇损伤的适应性反应。SJZD可以在mRNA水平和蛋白水平有效激活Nrf2及其下游靶基因HO-1和NQO1表达，这可能是SJZD保护GES-1细胞免受乙醇损伤的机制。因此，我们又用Nrf2的选择性抑制剂ML385进行研究，结果显示ML385消除了SJZD汤对GES-1细胞的保护效应，表明SJZD对胃黏膜上皮细胞的保护作用依赖于Nrf2的激活。我们的研究结果也支持了之前的假设。

本研究通过四君子汤在动物和细胞实验体外效应机制研究，验证了四君子汤通过激活Nrf2相关的抗氧化通路应答，减轻乙醇诱导的小鼠胃黏膜损伤。