呋塞米对脑出血模型大鼠PERK/eIF2α/CHOP通路及继发性脑损伤的影响

张 瑜，高建洲，韩 韶

(邯郸市第一医院 东院区 神经外科，河北 邯郸 056000)

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是因脑血管破裂而引起的一种脑血管疾病，造成的脑实质内出血可对神经系统功能造成严重损害，ICH发病急、进展快，致残率、病亡率极高，且预后不佳，给患者身心健康造成极大威胁[1]。内质网应激在ICH后继发脑损伤的病理过程中起到重要作用，可造成脑水肿和神经元凋亡，引发神经功能障碍，另外，内质网应激导致的神经炎性反应会进一步加重脑损伤，因而抑制内质网应激可提高神经元存活率，减轻脑损伤[2]。RNA 依赖的蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase RNA-like ER kinase，PERK)/真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)/转录因子CCAAT增强子结合蛋白的同源蛋白(CCAAT enhan-cer binding protein-homologous protein，CHOP)通路是调控内质网应激的主要信号通路，在缺血/再灌注损伤、炎性反应和神经系统疾病等病理机制中起着关键的调控作用，下调该通路蛋白表达可减弱内质网应激，抑制炎性反应，降低神经细胞凋亡率，减轻脑组织损伤[3-4]，因而抑制PERK/eIF2α/CHOP信号通路激活可作为ICH的潜在治疗手段。呋塞米(furosemide,FUR)是临床常用的一种高效利尿药，可抑制肾小管对钠钾离子重吸收，促进水分排泄，起到强效利尿作用，还可阻止钠离子进入脑组织，减少脑脊液生成，降低颅内压，减轻脑水肿，对ICH疗效显著，广泛用于临床[5]，但其对ICH大鼠PERK/eIF2α/CHOP通路及继发性脑损伤的影响，目前还未有明确阐述，本文通过构建ICH大鼠模型，对此进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物: SD大鼠，雄性，SPF级，体质量200～240 g，济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物合格证号SCXK(鲁) 2019 0003，参照《中华人民共和国实验动物管理条例》饲养在本院动物房，温度为22 ℃～25 ℃，湿度为45%～55%，噪音≤50 dB，大鼠自由进食及饮水，光照昼夜循环(12 h/12 h)，适应性喂养1周，用于后续实验。

1.1.2 主要试剂: Ⅳ型胶原酶(上海一研生物科技有限公司)；呋塞米(furosemide，FUR)注射液(遂成药业股份有限公司)；单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液(齐鲁制药有限公司)；Evans蓝(上海钰博生物科技有限公司)；HE染色试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)；大鼠γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)及白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒、兔源PERK、CHOP及p-eIF2α一抗、羊抗兔二抗(Abcam公司)；兔源p-PERK及β-tubulin一抗、鼠源eIF2α一抗(Santa Cruz公司)；羊抗鼠二抗(Cell Signaling Technology公司)；RIPA裂解液(上海吉至生化科技有限公司)；BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理: 参照文献[6]，将大鼠分为假手术组、模型组(脑定位注射Ⅳ型胶原酶,建立ICH模型)、FUR-L、FUR-M、FUR-H组及神经节苷脂干预组，每组18只。分别配制为1、2、4 mg/mL的FUR[8]溶液和5 mg/mL单唾液酸四己糖神经节苷脂钠[9]溶液，药物处理组大鼠均经尾静脉注射给药，剂量为1 mL/kg，假手术组与模型组大鼠均尾静脉注射1 mL/kg的0.9%氯化钠溶液，每天1次，持续14 d。

1.2.2 大鼠神经功能缺损的检测: 第14天给药后24 h，根据各组大鼠行为活动情况检测其神经功能，并参照Longa评分[7]法进行评分，从行为活动正常到死亡共分为5级，得分从0到5分。

1.2.3 大鼠血脑屏障损伤的检测：神经功能缺损检测结束后，进行Evans蓝外渗实验检测大鼠血脑屏障损伤：各组大鼠均随机选取6只，以5 mL/kg的剂量股静脉注射2% Evans蓝染料，1 h后以乙醚麻醉，切下鼠头，解剖分离大脑，称量湿质量，以60 ℃甲酰胺对其浸泡，24 h后运用分光光度计测量浸出液中Evans蓝含量。

1.2.4 标本收集及大鼠海马神经元损伤情况的检测：各组大鼠再次随机选取6只，自尾静脉取血3 mL后麻醉处死，取出大脑，称量湿质量，将其置于烤箱中烤干，称量干质量，计算大脑含水量，公式：大脑含水量=(大脑湿质量-大脑干质量)/大脑湿质量×100%。将上述血液放入4 ℃，3 000 r/min离心15 min，吸取上清储存在-80 ℃备用。各组最后剩余的6只大鼠，经麻醉后处死，解剖获得大脑，取下相同部位脑组织约0.5 g储存在液氮中备用；剩余脑组织经0.9%氯化钠溶液漂洗后，置于特制小盒中，以OCT(optimal cutting temperature compound)包埋剂浸没组织，放入液氮中速冻成块，采用冰冻切片机做常规病理切片，置于室温30 min后，以4 ℃丙酮固定10 min，参照试剂盒说明书的操作步骤进行HE染色，经75%、90%、100%乙醇依次脱水、二甲苯透明后，转移至载玻片上封片，以显微镜采集任意5个视野图像。

1.2.5 ELISA检测大鼠血清IFN-γ、IL-6水平：参照ELISA试剂盒说明书的操作步骤，检测血清其中各炎性因子IFN-γ、IL-6水平。

1.2.6 免疫印迹法检测大鼠脑组织PERK/eIF2α/CHOP通路相关蛋白表达：取出1.2.4中各组大鼠脑组织，加入1.5 mL RIPA裂解液，匀浆后4 ℃，3 000 r/min离心20 min，以BCA法测量上清中总蛋白浓度，然后将各样本浓度根据结果调至相同，加入上样缓冲液，煮沸6 min变性，各取20 L样品液上样，电泳后湿转，均于恒压110 V下进行，将所得硝酸纤维素膜根据分子质量剪下目的蛋白条带，以5%脱脂奶粉溶液于室温下孵育2 h，封闭膜上蛋白非特异性位点，然后分别加入兔源PERK、CHOP、p-eIF2α、p-PERK、β-tubulin一抗和鼠源eIF2α一抗，4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液漂洗，加入对应的羊抗兔及羊抗鼠二抗，室温孵育2 h，TBST缓冲液漂洗，通过化学发光法对蛋白条带显影，然后放入凝胶成像仪中拍照，运用Image-J软件得到蛋白条带灰度值，并对各蛋白表达进行定量分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 呋塞米(FUR)对大鼠神经功能损伤的影响

模型组大鼠Longa评分相比假手术组明显升高(P<0.05)。FUR-L、FUR-M、FUR-H组及神经节苷脂组大鼠Longa评分相比模型组均降低(P<0.05)(图1)。

*P<0.05 compared with sham operation group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with FUR-L group; ▲P<0.05 compared with FUR-M group图1 大鼠Longa评分Fig 1 Neurological function Longa Score of rats

2.2 呋塞米(FUR)对大鼠脑水肿的影响

模型组大鼠大脑含水量相比假手术组明显升高(P<0.05)。FUR-L、FUR-M、FUR-H组及神经节苷脂组大鼠大脑含水量相比模型组均降低(P<0.05)(图2)。

*P<0.05 compared with sham operation group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with FUR-L group; ▲P<0.05 compared with FUR-M group图2 大鼠大脑含水量Fig 2 Water content of rat brain

2.3 呋塞米(FUR)对大鼠血脑屏障损伤的影响

模型组大鼠Evans蓝渗出量相比假手术组明显升高(P<0.05)。FUR-L、FUR-M、FUR-H组及神经节苷脂组大鼠Evans蓝渗出量相比模型组均呈剂量依赖性降低(P<0.05)(图3)。

*P<0.05 compared with sham operation group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with FUR-L group; ▲P<0.05 compared with FUR-M group图3 大鼠Evans蓝渗出量Fig 3 Evans blue exudation in rats

2.4 呋塞米(FUR)对大鼠海马神经元损伤的影响

假手术组大鼠海马神经元无损伤；模型组大鼠海马神经元变性坏死，皱缩变小，数目明显减少，呈现严重病理损伤；相比模型组，FUR-L、FUR-M、FUR-H组及神经节苷脂组大鼠脑海马神经元病理损伤均减轻，且FUR各组随剂量升高，海马神经元病理损伤减轻程度增强，相比经节苷脂组，FUR-H组大鼠海马神经元病理损伤减轻程度差异无统计学意义(图4)。

2.5 呋塞米(FUR)对大鼠血清IL-6及IFN-γ水平的影响

模型组大鼠血清IL-6及IFN-γ水平相比假手术组明显升高(P<0.05)。FUR-L、FUR-M、FUR-H组及神经节苷脂组大鼠血清IL-6及IFN-γ水平相比模型组均降低(P<0.05)(图5)。

2.6 呋塞米(FUR)对大鼠脑组织PERK/eIF2α/CHOP通路相关蛋白表达的影响

模型组大鼠脑组织PERK/eIF2α/CHOP通路相关蛋白p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表达水平相比假手术组明显升高(P<0.05)。FUR-L、FUR-M、FUR-H组及神经节苷脂组大鼠脑组织PERK/eIF2α/CHOP通路相关蛋白p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表达水平相比模型组均降低(P<0.05)(图6)。

3 讨论

ICH易发于中老年群体，发病迅速，病情危重，易引发偏瘫、神经功能缺损等后遗症，如今仍是一个尚未解决的医学难题[10]。内质网是一种膜性细胞器，脑实质出血后，形成的血肿可刺激神经细胞产生内质网应激反应，引发严重的神经炎性反应，造成神经功能缺损及脑水肿，最终引发继发性脑损伤[11]。本文采用脑定位注射Ⅳ型胶原酶的方法建立ICH大鼠模型，结果表明Ⅳ型胶原酶可造成脑实质出血，诱发神经炎性反应，引起脑水肿，神经元凋亡，血脑屏障受损，最终导致神经功能障碍。

研究显示，减轻脑水肿，对减轻ICH脑损伤具有重要意义，因而利尿脱水是ICH的有效治疗方法，FUR作为一种强效利尿剂，可对肾小管髓袢升支粗段发挥作用， 在ICH的临床治疗中得到了广泛应用[12]，但其药理机制目前还未有详细的阐释。PERK/eIF2α/CHOP通路是主要的内质网应激通路，当内质网受到氧化应激、缺血/再灌注、钙离子代谢紊乱及糖基化反应异常等病理因素刺激时，会发生应激反应， 此时PERK/eIF2α/CHOP信号通路激活，引发细胞凋亡和组织损伤，下调PERK及eIF2α磷酸化水平，可抑制CHOP蛋白表达，降低内质网应激，减少细胞凋亡，改善脑血管及肾组织损伤[13-14]，因而推测，FUR可能下调PERK/eIF2α/CHOP通路，抑制ICH后内质网应激，进而缓解其继发性脑损伤。本文结果显示，ICH大鼠经FUR处理后，其海马神经元病理损伤有不同程度减轻，另外大鼠Longa评分、Evans蓝渗出量、大脑含水量、血清IFN-γ及IL-6水平、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表达水平均降低，且呈剂量依赖性，表明FUR可下调PERK/eIF2α/CHOP通路蛋白表达，抑制内质网应激及炎性反应，减少海马神经元凋亡，缓解脑水肿，改善ICH大鼠神经功能障碍。

A.sham operation group；B.model group；C.FUR-L group；D.FUR-M group；E.FUR-H group；F.ganglioside group图4 HE染色检测大鼠海马神经元损伤情况Fig 4 HE staining was used to detect the damage of hippocampal neurons (scale bar=50 μm)

*P<0.05 compared with sham operation group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with FUR-L group; ▲P<0.05 compared with FUR-M group图5 ELISA检测大鼠血清IL-6及IFN-γ水平Fig 5 ELISA was used to detect the serum levels of IFN-γ and IL-6 in rats(pg/mL)

综上所述，FUR可降低PERK、eIF2α磷酸化水平，下调CHOP蛋白表达，减弱内质网应激及炎性反应，缓解脑水肿和神经元损伤，减轻ICH引发的继发性脑损伤，促使神经功能修复，抑制PERK/eIF2α/CHOP信号通路激活可能是其药理机制之一，但本文只做了初步探究，还存在一定不足，后续还应使用该信号通路激活剂及抑制剂进行对照验证。

A.sham operation group；B.model group；C.FUR-L group；D.FUR-M group；E.FUR-H group；F.ganglioside group; *P<0.05 compared with sham operation group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with FUR-L group; ▲P<0.05 compared with FUR-M group