基于网络药理学和分子对接探讨黄秦艽治疗炎症性肠病作用机制

何彩静，秦德新，梁帅，刘师佺，李竣，黄先菊*

（1 中南民族大学 药学院，武汉 430074；2 博白县人民医院，玉林 537600）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一种非特异性结肠炎，主要包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩症（Crohn's disease，CD），具有腹痛、腹泻和粪便黏稠带脓血等症状［1］.目前，IBD发病率在全球范围内呈上升趋势，在西方国家患病率为10%~20%，而在发展中国家或地区更为严重［2-3］.西医治疗IBD主要使用5-氨基水杨酸类（柳氮磺吡啶）和免疫抑制剂等药物，但具有耐药性和肠道菌群失调等副作用，这严重影响了患者的预后生活［4］.因此，探究IBD的病理机制，寻找IBD的治疗新靶点和新药物，对于应对当前的IBD防治挑战具有重要意义.

黄秦艽（Veratrilla bailloniiFranch）是龙胆科滇黄芩属植物黄秦艽的干燥根［5］，具有清热、解毒、消炎、杀虫等功效，民间常用于治疗痢疾、便血、肠炎、急慢性胃炎等消化系统疾病［6-7］，且疗效显著，复发率低［8］.有关黄秦艽化学成分的研究较少，已有研究表明其主要化学成分是黄酮类化合物［9］.目前尚无黄秦艽治疗IBD的研究报道.本研究利用网络药理学和分子对接技术初步预测并验证了黄秦艽对IBD的药理活性及作用机制，为黄秦艽更广泛地应用于肠炎等疾病提供科学可靠的依据.

1 材料和方法

1.1 黄秦艽活性成分收集

以“黄秦艽”为检索词，利用TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）构建黄秦艽数据库，以口服吸收率（OB≥30%）及类药性（DL≥0.18）作为药物筛选条件［10］，使用PubChem（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）进行确证，并以M1~M14命名这14种成分.

1.2 预测和筛选潜在靶点

通过Swiss Target Prediction（http：//www.Swisstarget prediction.ch/）和STITCH（http：//stitch.embl.de/）预测黄秦艽14种活性成分作用靶点，并将概率值大于0.5的大分子作该成分的潜在有效靶点，构建活性成分-靶点交互作用网络.以“ulcerative colitis，UC”、“Crohn's disease，CD”、“chronic enteritis”为关键词，利用Gene Cards（https：//www.genecards.org/）和OMIM（https：//omim.org/）等数据库，获取IBD相关作用靶点.

1.3 黄秦艽与IBD交集的靶点网络（PPI）的构建

将黄秦艽活性成分靶点和IBD疾病靶点分别在STRING数据库（http：//stringdb.org/）制作成分-靶点PPI和疾病-靶点PPI图.Cytoscape绘制黄秦艽与IBD“药物-成分-疾病-靶点作用网络图”.以degree在中位数和最大值之间为筛选范围进行筛选［10］，获得黄秦艽治疗IBD作用的核心靶点.

1.4 GO分类富集分析和通路分析

将核心靶点导入David数据库（https：//david-d.ncifcrf.gov/）.物种设置为人类，GO分析和KEGG通路分析（P<0.05）.结合KEGG数据库和Reactome数据库进行通路注释分析.

1.5 “药物成分-作用靶点-作用通路”网络的构建

将上述黄秦艽的活性成分、靶点预测结果、通路分析及对应疾病，导入Cytoscape软件，构建“药物成分-作用靶点-作用通路”网络.

1.6 分子对接验证

TCMSP网站检索黄秦艽主要活性成分的3D结构式保存为*mol2格式，并使其能量最小化.从PDB数据（https：//www.rcsb.org/）下载关键蛋白的3D结构*PDB格式，导入Sybyl X 2.0软件，对蛋白进行处理，确定对接位点.采用半柔性对接方法将活性成分与已处理的蛋白用Surflex-Dock模块进行对接.

1.7 细胞实验

1.7.1 试剂与药材

胎牛血清、MEM培养基（Hyclone）；苦龙胆酯苷（AG）（上海源叶生物，HPLC≥98%，Lot：B20683）；脂多糖（LPS）（北京赛因坦）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒、白细胞介素-6（IL-6）ELISA试剂盒（碧云天）.

黄秦艽水提物（WVBF）［9］临用前用MEM培养基稀释至给药浓度（25 μg/mL）.

1.7.2 细胞

小鼠单核巨噬细胞白血病RAW264.7细胞株购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（CTCC）.

1.7.3 细胞培养

RAW264.7细胞加入含有青霉素、链霉素及10%胎牛血清的MEM培养液，置于5% CO237℃培养箱中常规培养.待细胞融合达80%~90%，用0.25%胰蛋白酶消化传代.

1.7.4 细胞活力检测

1×105个/孔的细胞密度接种在含10%FBS的MEM的96孔板中静置24 h.将细胞分为对照组、LPS组、LPS+AG（2 μg/mL）组、LPS+WVBF-L（12.5 μg/mL）组和WVBF-H（25 μg/mL）组.先在相应剂量的药物下 培 养6 h，再用LPS（1 μg/mL）诱导24 h后，按照MTT试剂说明书检测490 nm处各孔的吸光度（A490）.细胞活力=药物组A490/对照组A490×100%.

1.7.5 ELISA检测细胞中TNF-α和IL-6的含量

先按照“1.7.4”分组给予相应剂量的药物预处理24 h后，收集细胞上清液.根据ELISA试剂盒说明书检测细胞上清液中TNF-α和IL-6的含量.

1.7.6 RT-PCR检测MMP2、MMP9基因的表达

细胞密度调整为5×106个/mL，以每孔0.2 mL细胞悬液接种于6孔板，贴壁生长后吸去上清液.先按照“1.7.4”分组给予相应剂量的药物预处理24 h后，收集细胞.Trizol试剂从细胞中提取总RNA，并将其反转录为cDNA.PCR反应条件为：98℃变性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40个循环.该反应的引物如表1所示，每个样品测量3次.通过2-ΔΔCt方法计算相关基因相对于GAPDH的表达.

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of RT-PCR

2 结果

2.1 化学成分筛选与靶点预测

通过TCMSP筛选并结合文献得到黄秦艽14种主要成分，并M1~M14命名（表2）.

表2 黄秦艽14种主要成分信息Tab.2 14 main constituents of Veratrilla baillonii Franch

2.2 黄秦艽与肠炎疾病交集的靶点网络（PPI）分析

通过网络预测获得黄秦艽14个活性成分对应的潜在靶点278个，获得肠炎对应的靶点1445个，交集后获得85个共同靶点，该网络包括85个节点和492条边（图1）.

图1 黄秦艽与肠炎疾病交集的靶点网络Fig.1 Target network of Veratrilla baillonii Franch and IBD

2.3 黄秦艽治疗肠炎作用核心靶点分析结果

黄秦艽与肠炎疾病交集的核心靶点网络包括42个节点和374条边.在核心靶点网络中（图2，表3），STAT3（44）、TNF（42）、EGFR（42）、CASP3（41）、HRAS（37）、PTGS2（30）、MTOR（29）、MMP9（29）、ESR1（28）、KDR（27）、MAPK14（27）、MMP2（26）、IL2（24）、PIK3CA（23）、PIK3R1（21）等是度值较大的节点，这些节点可能在黄秦艽治疗肠炎过程中发挥重要作用，为治疗肠炎作用关键靶点.

表3 蛋白互作网络核心靶点信息Tab.3 Core targets of protein interaction

图2 黄秦艽与肠炎疾病交集的核心靶点网络Fig.2 Core target network of intersection between Veratrilla baillonii Franch and IBD

2.4 GO富集分析和通路分析

2.4.1 GO富集分析

GO分析结果显示，核心靶点主要参与表皮生长因子受体信号通路、白细胞迁移、活性氧代谢过程、细胞氧化应激反应的调节、磷脂酰肌醇介导信号通路、细胞增殖等54条重要过程.获得BP相关条目140条，主要涉及炎症反应的调节、白细胞-细胞黏附的调节、细胞因子活性、激酶调节活性、氧化应激反应、凋亡信号通路的调控等方面，对前32条进行分析（图3（a））；CC相关的条目25条，主要涉及细胞间隙、胞外区和细胞膜等方面（图3（b））.由此可见，黄秦艽治疗IBD存在复杂的多靶点、多通路机制和多生物过程的特性.

图3 GO富集分析网络图Fig.3 GO function enrichment analysis

续表

2.4.2 KEGG通路富集分析

对黄秦艽治疗IBD的核心靶点进行KEGG分析得到81条通路途径（P<0.05），取前36条通路（图4）.其中疾病通路主要包括癌症、结直肠癌和胰腺癌等；炎症相关通路主要包括血管内皮生长因子（VEGF）和磷脂酰肌醇激酶（PI3K）等.由结果可知，黄秦艽治疗IBD可能与调节癌症通路、TNF信号通路、VEGF信号通路、ras信号通路、T细胞受体信号通路、幽门螺杆菌感染上皮细胞转导信号通路、ErbB信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、胆碱代谢信号通路、白细胞迁移和鞘脂类等重要通路有关.

图4 KEGG富集通路Fig.4 KEGG analysis of enrichment pathways

2.5 “成分-靶点-通路”网络的构建

“成分-靶点-通路”网络结果显示（图5），该网络有94个节点和419条边.其中度值较大的1-羟基-2，3，7-三甲氧基酮（1-hydroxy-2，3，7-trimethoxyxanthone，M6，23）、1，7-二羟基-3-甲氧基酮（1，7-dihydroxy-3-methoxyxanthone，M2，22）、1-羟基-2，3，4，7-四甲氧基酮（1-hydroxy-2，3，4，7-tetramethoxyxanthone，M4，13）、苦龙胆酯苷（Amarogentin，M7，6），这可能是黄秦艽作用于IBD的主要活性成分.度值较大的靶点有磷脂酰肌醇激酶催化亚单位A（PIK3CA，34）、磷脂酰肌醇3激酶调节亚单位1（PIK3R1，34）、磷脂酰肌醇3激酶（PIK3CG，34）和（HRAS，32）等，这些可能是黄秦艽干预IBD的重要靶点.

图5 “药物成分-作用靶点-作用通路”网络图Fig.5 Network diagram of"drug component-target-pathway"

2.6 主要成分-关键靶点的分子对接

将PPI蛋白互作网络中Degree≥17的靶点蛋白与黄秦艽9个活性成分（表4）进行分子对接验证.结果显示（图6（a）），对接得分>7的潜在蛋白靶点包括TNF、EGFR、CASP3、HRAS、PTGS2、MTOR、ESR1、KDR、MMP2、PIK3R1、PIK3CA、HDAC1；对接得分>5的潜在蛋白靶点包括STAT3、IL2、MMP3、MMP1、MMP7.其中，Amarogentin与MMP2之间的对接得分最高（8.7129），Tripteroside和PIK3CA之间的对接得分次之（8.7084），这表明它们之间具有较强的结合性（如图6（b））.

表4 黄秦艽9个活性成分的相关信息Tab.4 9 active components of Veratrilla baillonii Franch

图6 成分-核心靶点的分子对接结果Fig.6 Molecular docking results of composition-core target

2.7 WVBF对LPS诱导的RAW264.7细胞的干预影响

与空白组相比，模型组的细胞活力显著下降（P<0.001），TNF-α、IL-6释放量和MMP2、MMP9表达显著升高（P<0.001）；经AG和WVBF低、高剂量干预后的细胞活力显著升高（P<0.05或P<0.001），TNF-α、IL-6、MMP2、MMP9水平显著下降（P<0.05，P<0.01或P<0.001）（图7）.WVBF可能通过抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症因子的释放，降低MMP2和MMP9的表达水平，进而发挥抗炎作用.这与网络药理学预测的结果相一致.

图7 WVBF对LPS诱导的RAW264.7细胞的干预作用Fig.7 Intervention of WVBF on LPS-induced RAW264.7 cells

3 讨论

近年来，遗传、环境、肠道菌群以及免疫炎症等因素被认为是导致IBD的主要原因，其中免疫炎症被认为是导致IBD重要因素之一［11］.白介素（IL）、信号传导及转录激活蛋白（STAT）、肿瘤坏死因子（TNF）、基质金属蛋白酶（MMP）等与免疫炎症密切相关的促炎因子能介导IBD的发展［12］.STAT3蛋白在调节细胞因子依赖的免疫炎症中起关键作用［13］.肠黏膜中STAT3信号通路被激活后可诱导肠道中IL-6、TNF-α的释放，加重肠道炎症反应［14］.研究发现MMP2和MMP9在炎症因子的生成等方面起着重要作用［15］，且在IBD等肠道局部损伤和炎症中高表达［16］.本研究结果亦表明，黄秦艽治疗IBD的潜在靶点主要涉及TNF、IL2、MMP2、MMP9等促炎因子.

黄秦艽化学成分研究表明［17］，1-羟基-2，3，5-三甲氧基酮可显著降低LPS致伤小鼠中一氧化氮（NO）和炎性因子水平的作用［18］，进而有效抑制IBD等消化系统性疾病的发展［19］；Amarogentin可通过激活MAPK酶抑制TNF-α诱导的炎症，减少炎症因子的释放达到保护肠道的目的［20］.本研究按度值高低筛选出Amarogentin、Tripteroside、1，7-二羟基-3-甲氧基酮、1-羟基-2，3，5-三甲氧基酮、1-羟基-2，3，4，7-四甲氧基酮5个关键成分，且分子对接结果显示这些成分都能与靶点蛋白较好地结合；细胞实验结果也显示，黄秦艽及Amarogentin能显著调节TNF、IL2释放量和MMP2、MMP9的表达水平.提示这些成分可能是黄秦艽治疗IBD的主要活性成分，黄秦艽可作为治疗IBD的潜在药物.

根据KEGG分析，黄秦艽治疗IBD的主要通路有VEGF、PI3K/Akt和TNF等 通 路.有 研 究 发 现VEGF在IBD患者血清中的水平显著高于健康人群，提 示IBD诱 导 的VEGF信 号 通 路 被 激 活［21］.VEGF在IBD的炎症组织中表达增强，可以影响肠道黏膜微循环，加重肠溃疡上皮组织损伤［22］.有研究发现PI3K/Akt通路可以抑制细胞凋亡［23］、促进细胞增殖以修复肠道黏膜的损伤［24］.提示黄秦艽可能通过调控VEGF信号通路和PI3K/Akt通路激活，从而改善肠黏膜氧化损伤，逆转IBD恶化发展.