攀枝花和会东地区中华块菌营养成分检测及含量差异化分析

余晓瑞,裴沪荣,龙力,方磊,龙章富

(四川大学 生命科学学院,四川 成都,610065)

块菌(Truffle)是一种珍稀食药两用真菌,属于盘菌纲(Discomycetes)、块菌目(Tuberales)、块菌科(Tuberaceae)、块菌属(Tuber)[1]。目前我国已发现的块菌资源有60余种,其中西南地区资源最为丰富[2],而攀枝花和会东是我国最早开发块菌资源的地区。国产黑块菌包括印度块菌复合种、中华夏块菌、假凹陷块菌等,其中中华块菌属于印度块菌复合种[3]。

块菌子实体中含有丰富的蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素等成分,块菌含有能够增强机体免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抑菌等活性成分[4-5]。块菌中所含的尿苷能作为药物治疗贫血以及心血管方面的疾病,肌醇能够降低胆固醇、促进毛发生长、供给脑细胞营养等,花生四烯酸在维持机体细胞膜的结构与功能方面发挥着重要的作用[6]。目前国内块菌研究主要集中在对块菌形态、孢子形态以及挥发性物质研究,且以块菌干品为对象的研究较多,对新鲜块菌以及攀枝花地区和会东地区块菌成分差异性对比分析的相关研究较少,传统方法无法有效区分块菌产地,内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)鉴定的方法适合于真菌物种的鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的鉴定分析,会东和攀枝花的中华块菌在ITS间隔区上差异较小,所以只用ITS分子鉴定法不能区分两地中华块菌。

本文利用GC-MS技术对来自攀枝花和会东地区的中华块菌组成成分和含量进行检测,通过主成分分析方法(principal components analysis,PCA)、偏最小二乘分析法(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)进行化学计量学分析,分析了两地块菌的组成成分、对比了两地成分含量的差异。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

块菌(新鲜),分别采自凉山州会东县嘎吉镇,攀枝花市中坝乡(2021年1月,经ITS鉴定为中华块菌)。

会东嘎吉镇：属中亚热带湿润季风气侯区,光热资源丰富,四季如春,昼夜温差大,雨量集中,干湿季分明,多年平均降水量1 058 mm,雨热同季,地貌气候复杂多样,垂直差异十分明显。

攀枝花中坝乡：属于亚热带季风及南亚热带亚湿润气候,夏季长,日温差大,年温差小,降雨少而集中,冬半年日照充足,少雨干暖；夏半年云雨较多,气候凉爽；由于地形的多样性,气候垂直差异显著。

甲醇、乙腈、己烷、异丙醇、N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺、三甲基一氯硅烷、甲氧基胺盐酸盐、吡啶、肉豆蔻酸(D27,98%),美国默克公司。

1.2 仪器与设备

7890A气相色谱仪、5975C MSD质谱仪、DB5-MS(30 m×250 μm×0.25 μm)色谱柱,安捷伦科技(中国)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 块菌样品准备

对来自攀枝花市的新鲜块菌组编号为PZH-B组,会东县的新鲜块菌组为PZH-S组。每组3个重复。

1.3.2 GC-MS样本的制备

称量5 mg块菌样本,加入1 mL提取剂[V(异丙醇)∶V(乙腈)∶V(水)=3∶2∶2],加入5 μL 3 mg/mL肉豆蔻酸(D27,98%)溶液,涡旋 1 min；4 ℃,13 000 r/min离心5 min,取800 μL上清液氮吹干燥。

衍生化处理：首先加入20 μL 40 mg/mL甲氧基胺盐酸盐/吡啶,30 ℃衍生90 min；接着加入90 μL含体积分数1%三甲基一氯硅烷的N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺,37 ℃衍生 30 min,4 ℃离心(13 000 r/min)5 min,取60 μL的上清液上机检测。

1.3.3 检测条件

采用Agilent DB5-MS(30 m×250 μm×0.25 μm)色谱柱,体积流量1.1 mL/min,分流比为10∶1,进样口温度250 ℃,接口温度230 ℃。色谱柱升温方式为程序升温,起始温度60 ℃,保持1 min。以10 ℃/min的速率升到300 ℃,保持10 min。质谱条件：离子源温度250 ℃,四级杆温度150 ℃,溶剂延迟5.9 min,检测范围m/z50～500。

1.3.4 数据处理

将采集到的原始数据使用Agilent Chrom Station software(Agilent Technologies,USA)转换成通用格式。在R软件平台下,进行峰的识别,保留时间对齐,自动积分等预处理。使用梦图数据库进行数据图谱对比,匹配度大于80%作为鉴定依据,对所测的成分进行定性定量分析。

2 实验结果

2.1 攀枝花和会东地区中华块菌的PCA

本研究将PZH-B和PZH-S两组通过GC-MS检测得到的成分进行主成分分析,结果如图1所示。PC-1(49.6%)与PC-2(21.7%)累计方差贡献率为71.3%,说明降维时保留了GC-MS结果的主要有用信息,能够较好地反映结果信息。PZH-B和PZH-S两组团聚性都较差,PC-1与PC-2未能将PZH-B组和PZH-S组分离开,表明攀枝花中华块菌和会东中华块菌的组成成分差异小。

图1 攀枝花和会东块菌主成分分析Fig.1 PCA of T.sinense (Panzhihua) and T.sinense (huidong)

2.2 攀枝花和会东中华块菌中检测出的氨基酸

选取攀枝花地区和会东地区1月的新鲜块菌组织进行GC-MS检测,将得到的产物进行分类,攀枝花地区块菌和会东地区块菌共鉴定出15种氨基酸,如表1所示。

表1 两地块菌中检测出的氨基酸成分Table 1 Amino acid components detected in truffles from two areas

15种氨基酸中有8种为必需氨基酸：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸；7种为非必需氨基酸：脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、赖氨酸。氨基酸是块菌特征风味化合物之一。其中天冬氨酸是鲜味型；苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸是甜味型；缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸是苦味型。陶恺等[7]在对中国块菌的营养价值鉴定中表明,中国块菌蛋白质含量丰富,富含人体所需的8种必需氨基酸,而黑孢块菌中甲硫氨酸未被检测出；任新军等[8]在对中华夏块菌、假喜马拉雅块菌、攀枝花白块菌的氨基酸检测中未检测出半胱氨酸。不同地区的块菌氨基酸成分不同可能与当地气候环境、降水等因素有关。

2.3 攀枝花和会东中华块菌中的糖类测定

选取攀枝花地区和会东地区1月的新鲜块菌组织进行GC-MS检测,将得到的产物进行分类,攀枝花地区块菌和会东地区块菌共鉴定出10种糖类(表2),分别为岩藻糖、2-脱氧-L-核糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、N-乙酰氨基葡萄糖、棉子糖。糖类是块菌成分中重要的组成成分之一,块菌抗氧化活性、调节机体免疫力、抗肿瘤抗癌的作用都与其体内的多糖有关。李美凤等[9]在对块菌的多糖提取、分离和结构鉴定实验中表明块菌多糖是由甘露糖、葡萄糖和鼠李糖组成,其中葡萄糖的含量高达95%。BHOTMANGE等[10]对块菌多糖进行提取的实验中表明,鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖是多种块菌多糖的重要组成成分；有的块菌也含有特殊多糖,如岩藻糖、阿拉伯糖,如印度块菌、棕红块菌[11-12]。

表2 两地块菌中检测出的糖类成分Table 2 Saccharides detected in truffles from two areas

2.4 攀枝花和会东县块菌中的有机酸

选取攀枝花地区和会东地区1月的新鲜块菌组织进行GC-MS检测,将得到的产物进行分类,攀枝花地区块菌和会东地区块菌共鉴定出22种有机酸(表3),有机酸类化合物可作用于中枢神经,具有抗菌,升高白细胞等作用[13]。ANGELINIA等[14]研究表明,多不饱和脂肪酸是块菌脂肪酸的主要成分,主要为亚油酸、油酸、硬脂酸、棕榈酸。

表3 两地块菌中检测出的有机酸Table 3 Organic acids detected in truffles from two areas

2.5 攀枝花和会东中华块菌组成成分含量分析

将PZH-S组和PZH-B组中的6个新鲜松露样本进行PLS-DA分析,找到2组之间的差别。图2为PLS-DA分析成分含量差异的载荷图,能够反映组成成分对样本组间区分的贡献度,成分在loading 1和loading 2方向上离中心点(0,0)越远对区分样本组所作的贡献越大,通过图2可以看出,肌醇半乳糖苷、山梨醇、反油酸乙酯等多个组成成分距离中心点较远,它们对样本区分做出了突出贡献。通过这些有差异的物质可以对PZH-B组与PZH-S组进行区分。

图2 PLS-DA组成成分含量差异载荷图Fig.2 PLS-DA loading plot of different component

图3为2组具有显著性差异的15种组成成分及其在2组中的含量对比图,变量投影重要性指标(variable importance in projection,VIP)值越大,该成分在样本的区分中所作的贡献越大,红色为相对高浓度,蓝色为相对低浓度。通过图3可以看出,PZH-B与PZH-S在15种组成成分上有显著差异,并对这15种组成成分在2组中含量的高低做出了对比。在15种组成成分中,有10种成分PZH-S组含量高于PZH-B组,有5种PZH-B组含量高于PZH-S组。其中差异最大的组成成分为肌醇半乳糖苷,PZH-S组含量高于PZH-B组。PZH-S组中的尿苷、肌醇、2-哌啶甲酸、异亮氨酸、十八烷酸、脯氨酸、亚油酸、花生四烯酸、亮氨酸也高于PZH-B组。张世奇等[15]的研究中表明9-(E)-十八烯酸是会东块菌的主要香气成分之一。香气成分是块菌的品种重要指标之一,产地对食用菌的香气成分含量有重要影响[16-17]。1-辛烯-3-醇是大多数食用菌的重要芳香化合物之一,而亚油酸是合成1-辛烯-3-醇的前体[18]。本研究中对两地中华块菌成分含量通过PLS-DA进行差异成分分析,共找到了15种差异成分,肌醇半乳糖苷、尿苷、肌醇、亚氨基二乙酸、山梨醇、2-哌啶甲酸、正亮氨酸、亚油酸、异亮氨酸、3-羟基-吡啶、脯氨酸、9-(E)-十八烯酸、花生四烯酸、2-氨基-2-去甲菠烷羧酸、亮氨酸。其中,会东地区中华块菌在9-(E)-十八烯酸和亚油酸的含量上都高于攀枝花地区的块菌。

图3 显著性差异的组成成分及其在2组中的含量对比图Fig.3 Comparison of components with significant differences in content in truffles from two areas

3 结论

本文通过攀枝花和会东地区的中华块菌进行GC-MS检测,共检测出了15种氨基酸,其中8种为必需氨基酸。在会东和攀枝花块菌中检测出了10种糖类,在两地中均检测出岩藻糖,它是松露多糖的重要组成成分。在会东和攀枝花中华块菌中检测出22种有机酸,多为不饱和脂肪酸。在15种含量差异化组成成分中,有10种成分会东组含量高于攀枝花组,有5种攀枝花组含量高于会东组。其中差异最大的组成成分为肌醇半乳糖苷,会东组含量高于攀枝花组。会东组中的尿苷、肌醇、2-哌啶甲酸、异亮氨酸、十八烷酸、脯氨酸、亚油酸、花生四烯酸、亮氨酸也高于攀枝花组。

块菌具有丰富的营养成分和巨大的经济价值,块菌多糖和有机酸在块菌抗氧化、抑菌、抗肿瘤上发挥着重要作用[19]。随着对块菌研究的深入,块菌的价值被不断开发,通过对会东地区和攀枝花地区的块菌成分分析,找到了两地中华块菌在含量上有显著性差异的化合物,这有利于对中华块菌更好地进行产地区分,更合理地开采和利用块菌资源。