增强MRI 多功能直方图参数与三阴乳腺癌PD-L1 表达的相关性分析

李 骥 彭 飞 王 硕

河北省唐山市人民医院磁共振室，河北唐山 063000

[关键字]三阴乳腺癌；增强磁共振成像；直方图；程序性死亡配体1

三阴乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）均阴性的乳腺癌，与其他乳腺癌亚型比较，具有侵袭性强、早期复发率高、预后差等临床特点[1]。程序性死亡配体1（programmed death ligand 1，PD-L1）表达于多种肿瘤细胞表面，是程序性死亡因子1（programmed cell death 1，PD1）的配体之一，在介导乳腺癌细胞免疫逃逸中发挥重要作用。免疫治疗主要是通过阻断PD1/PD-L1 信号通路诱导肿瘤凋亡，PD-L1 的表达水平对三阴乳腺癌的免疫治疗也有重要的指导价值[2-4]。磁共振动态定量灌注既可以评估肿瘤形态学特征，还可以在分子水平检测肿瘤内部的代谢活动，评价其生物学行为。灌注参数的直方图分析法可基于各参数灰度像素值的概率分布（均值，偏度、峰度，百分位数等）对病灶的异质性进行描述[5-6]。但关于DCE-MRI 各功能参数与PD-L1 表达的相关性研究鲜有报道。因此，本研究旨在分析三阴乳腺癌的DCE MRI 的容量转运常数（volume transfer constant，Ktrans）、速率常数（rate constant，Kep）、血管外细胞外间隙容积分数（extravas cular extracellular volume fraction，Ve）的直方图参数与PD-L1 两者表达之间的相关性，以期全面评价DCE-MRI 多功能直方图参数无创性预测三阴乳腺癌PD-L1 表达的可行性与可靠性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2019 年12 月至2020 年6 月在河北省唐山市人民医院手术治疗的三阴乳腺癌患者52 例作为研究对象，均为女性，年龄（44.7±6.4）岁，经穿刺活检病理证实为三阴乳腺癌。所有患者均在穿刺或术前进行了DCE-MRI 扫描，且患者在进行MRI 检查及穿刺活检前均未行任何抗肿瘤治疗。本课题经河北省唐山市人民医院伦理委员会批准，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 MRI 检查

应用美国GE Signa HDx 3.0T 磁共振扫描仪。患者俯卧位，双侧乳腺悬垂于乳腺专用线圈内扫描。应用抑脂轴位3D 快速梯度回波（VIBRANT）序列，回波时间4 ms，TE 选取Minimum，翻转角15°，矩阵288×224，层厚2.2 mm，层间距0 mm，视野为400 mm，平均次数为1。采用高压注射器肘静脉团注对比剂钆喷替酸葡甲胺（gadolinium diethylenertriamine pentaacetic acid，GD-DTPA），剂量0.1 mmol/kg，注射速度3.0 ml/s。注射对比剂前扫描蒙片，注射对比剂后连续扫描8 个时相，单期扫描时间为46 s。

1.3 图像后处理及数据测量

将采集的原始图像导入Omni Kinetics 软件（GE公司），包括T1WI 蒙片及8 组动态增强序列图像。感兴趣区（ROI）设置：选取肿瘤中心（瘤体内1/4 区域）和边缘区域（瘤体外1/4 区域）作为感兴趣区，选取原则是肿瘤最大层面，面积在（10±5）mm2，同一病灶测量3 次，取平均值作为最终值。利用Extended Tofts Linear 双室模型计算相应区域、并测量各定量参数。软件自动计算Ktrans、Kep、Ve 的直方图参数。①Ktrans是指对比剂从血管腔内扩散到血管腔外的速度常数，单位为1/min。②Kep 指经过若干时间后，组织间隙内的对比剂重新回流到血管内的速度常数，单位为1/min。③Ve 是指血管外细胞外间隙占整个体素的容积比。（Ktrans、Kep 和Ve 三者间关系可表达为：Ve=Ktrans/Kep）。直方图参数包括平均值、最大值、最小值、峰度、偏度、第10 百分位数（P10）、第25 百分位数（P25）、第50 百分位数（P50）、第75 百分位数（P75）和第90 百分位数（P90）。

1.4 免疫组织化学检测

采用自动化Ventana anti-PD-L1（22C3）免疫组化检测系统（图1，见封三）。样本为手术切除或活检获取的石蜡包埋标本，常规切成4 μm 厚的白片。对于PD-L1 染色的白片要求需至少含有50 个可见的肿瘤细胞，对于免疫细胞评估需含有一定的肿瘤相关间质以便进行免疫浸润免疫细胞评分（immune cell score，IC）。质控组织为10%中性缓冲福尔马林固定的扁桃体组织，扁桃体组织同时含有阴性质控成分和阳性质控成分。PD-L1 表达采用IC 评分法和肿瘤细胞阳性比例评分（tumor proportion score，TPS）评分法进行判定，由2 名病理医师进行判读。①免疫细胞评估和评分方法：IC=肿瘤区域内任何强度PD-L1 染色的免疫细胞所占区域/肿瘤区域×100%，IC 值为0～1。肿瘤浸润免疫细胞染色阴性为无任何可辨别的PD-L1染色或肿瘤浸润性免疫细胞中任何强度的可辨别PD-L1 染色存在，其染色占据的肿瘤区域＜1%（＜1%IC）；PD-L1 阳性为肿瘤浸润性免疫细胞中任何强度的可辨别PD-L1 染色存在，其染色占据的肿瘤区域≥1%（≥1%IC），即IC≥1%为阳性表达。②TPS=任何强度下部分或完整膜染色的肿瘤细胞/所有肿瘤细胞×100%。TPS 分值为0～1 分。TPS＜1%为PD-L1 无表达；1%～＜50%为PD-L1 表达；≥50%为PD-L1 强表达，即TPS≥1%为PD-L1 阳性表达。

图1 免疫组织化学方法检测（100×）（见内文第31 页）

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对所得数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，采用Spearman 秩相关分析评价各直方图定量参数与乳腺癌PD-L1 的相关性。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三阴乳腺癌中Ktrans、Kep、Ve 直方图参数

52 例TNBC 患者DCE-MRI 直方图参数（Ktrans、Kep、Ve）见表1。图2～3 为1 例三阴乳腺癌患者MRI图像及其Ktrans、Kep、Ve 计算结果的直方图。

图2 三阴乳腺癌MRI 图像

表1 DCE-MRI 直方图参数值（）

表1 DCE-MRI 直方图参数值（）

2.2 三阴乳腺癌PD-L1 表达情况

在52 例患者的病灶中，TPS≥1%的患者11 例（21.15%），IC 评分中≥1%的患者21 例（40.38%），其中21 例IC 评分阳性的患者中包含了8 例TPS 评分阳性的患者。

2.3 DCE-MRI 各直方图参数与PD-L1 评分状态的关系

PD-L1 评分阳性是三阴乳腺癌应用免疫治疗方案的重要指标，依据PD-L1 阴性阳性评分标准对患者进行分组，评估PD-L1 评分状态与MRI 功能参数的相关性。结果显示，在IC 评分组中，PD-L1 阳性组Ktrans 均值、Ktrans P50值及Ktrans P75值高于阴性组（r=0.392、0.431、0.462，P <0.05）。此外，PD-L1 阳性组Kep 均值、Kep P25值及Kep P50值高于阴性组（r=0.336、0.471、0.426，P<0.05）。在TPS 评分组中，PD-L1评分状态在MRI 各功能参数比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。

图3 同一患者Ktrans、Kep、Ve 各参数直方图

3 讨论

三阴乳腺癌比其他类型的乳腺癌更具侵袭性且预后更差，更易转移、复发，同时其对内分泌治疗无效，靶向药物较少，是乳腺癌治疗中的一大难题[7-8]。近年来研究发现，三阴乳腺癌具有较高的肿瘤浸润性淋巴细胞浸润率及较高的PD-L1 表达率[9-12]，现已被认为是适合免疫检查点抑制治疗的乳腺癌最佳亚型。特别是在IMpassion130 研究中，PD-L1 阳性表达的患者无论是无进展生存期还是总生存期，均优于PD-L1阴性患者[13]，这为三阴乳腺癌的免疫治疗带来了新的契机。

PD-1/PD-L1 是免疫检查点中重要负向调控分子，在肿瘤免疫逃逸中起重要作用。肿瘤细胞表面高表达PD-L1，可与位于肿瘤浸润淋巴细胞表面的PD1结合，并向肿瘤浸润淋巴细胞传递免疫抑制信号，进而抑制T 细胞迁移、增殖及细胞毒性介质的分泌，诱导T 细胞耗竭，限制其对肿瘤细胞的杀伤作用，实现免疫逃逸[14-15]。目前由于PD-L1 在乳腺癌中的阳性阈值尚未明确，因此本项研究PD-L1 表达采用了临床试验中常用的两种评分方法，即TPS 和IC 评分法，研究发现在52 例患者中，TPS 的阳性率为21.15%，IC 的阳性率为40.38%，综合IMmotion150、IMvigor210、IMpassion130 等多项临床研究发现[13]，对于大多数肿瘤而言，IC 阳性患者同时包括了TPS 阳性的患者，本研究与既往的研究结果也发现了类似的结果，对于IC评分阳性的患者有8 例患者TPS 也是阳性的。目前已发现在肺癌、食管癌、胃癌等多种肿瘤中[13]，肿瘤细胞中PD-L1 表达升高，且常与患者的不良预后、复发转移及脉管生成相关。在本研究也观察到肿瘤组织中位于肿瘤细胞上PD-L1 蛋白的表达水平明显高于癌旁组织，此数据在结果中未列出。

DCE-MRI 是一种无创性反映形态学和血流动力学改变相结合的检查方法，为肿瘤的诊断和治疗提供了依据[16-17]，是评估肿瘤生长、转移及预后的常用影像学检查方式。Ktrans、Kep 和Ve 是DCE-MRI 常用的定量动力学参数，可以提供有关肿瘤生物学方面的信息。肿瘤的直方图分析可提供超出平均值更多的量化指标，定量反映肿瘤的异质性变化，重复性和一致性均较高[18-19]。因此，从DCE-MRI 得出的直方图参数可以更为客观地反映肿瘤微环境，尤其是肿瘤组织中的微血管密度。Li 等[20]研究发现动态增强参数Ktrans 与血管内皮生长因子具有很强的相关性，可用于肿瘤血管内皮生长因子受体分子靶向药物疗效的精准评估。尚海龙等[21]研究也发现乳腺癌MRI 参数Ktrans 和Kep 与增殖指数Ki-67 的表达呈正相关，可以预测肿瘤的增殖潜能。本研究显示，在IC 评分组中，PD-L1阳性患者具有更高的Ktrans 均值、Ktrans P50值及Ktrans P75值。此外，PD-L1 阳性患 者的Kep 均值、Kep P25值及Kep P50值亦明显高于阴性者，这些结果充分提示可以根据MRI 各功能参数评估PD-L1 的评分状态，为临床的免疫治疗提供早期依据。根据现有的研究数据[22-25]，三阴乳腺癌PD-L1 的表达与肿瘤的微血管密度和微淋巴管密度均呈正相关，提示PD-L1 参与了三阴乳腺癌的脉管生成，这也部分解释了该研究结果。此外，也提示Ktrans 直方图参数或与免疫微环境相关性不大，本研究结果也从另一方面证实三阴乳腺癌是一种具有明显异质性的恶性肿瘤。在本研究中并未发现直方图参数Ve 与PD-L1 的表达存在任何相关性。

本研究也具有一定的局限性。首先，由于入组患者例数所限，并未对基底样型及非基底样型此两种不同病理类型的乳腺癌进行分组探讨。其次，灌注图上ROI 的选取受主观因素影响较大，难以完全避开囊变、坏死及出血区，且由于三阴乳腺癌异质性较大，PD-L1 的表达在乳腺癌组织中亦具有明显的异质性。因此，需要在后续的研究中进一步扩大样本量证实该研究结果，进一步减少研究中可能存在的偏倚。

综上所述，增强MRI 直方图参数与三阴乳腺癌PD-L1 IC 评分存在相关性，为DCE MRI 多功能直方图参数无创性预测三阴乳腺癌PD-L1 表达的可行性提供了有力的支持。