VEGFR-3通过PI3K/AKT信号通路促进触液神经元增殖的作用机制

胡 茜 颜海健

贵州医科大学附属医院急诊科，贵州贵阳 550000

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）可致患者残疾[1-3]。神经干细胞巢中的触液神经元（cerebrospinal fluidcontacting neurons，CSF-CNs）的作用特殊，能通过释放活性物质促进神经修复[4-6]。血管内皮生长因子受体-3（vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3）是神经细胞生长的调节剂[7-9]，但机制有待探究。本实验首次研究VEGFR-3 对CSF-CNs 体外增殖的影响，通过观察VEGFR-3 对PI3K/AKT 信号通路的影响，探讨其促进脊髓修复的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SPF 级C57 新生3 d 健康小鼠10 只，体重1.5～2.5 g，雌雄不限，雅培奶粉（雅培公司，美国）喂养，贵州医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证SYXK（黔）2018-0001，实验动物合格证NO.43072621 010022871，经贵州医科大学实验动物伦理委员会许可。DMEM 培养基、雷帕霉素、牛血清（武汉汉万科技有限公司），VEGFR-3 质粒（上海博达有限公司），GAPDH、HRP 标记二抗、PI3K、VEGFR-3、AKT、p-AKT（上海碧云天生物有限公司，货号分别为AF5201、A0208、ab32089、ab182651、ab179463、ab8805）。

1.2 研究方法

1.2.1 CSF-CNs 获取及鉴定 C57 新生3 d 鼠取颈髓组织获得CSF-CNs，采用神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）鉴定CSF-CNs；利用CSFCNs 特异标志物PKD2L1 进一步验证，计算纯度：CSFCNs 纯度=PKD2L1 阳性细胞/DAPI 阳性细胞数[10]。实验独立重复3 次。

1.2.2 CSF-CNs 培养及分组处理 DMEM 培养液培养，隔日用含EDTA 的胰酶消化，当细胞密度达到80%，用胰蛋白酶进行消化传代。取CSF-CNs 分为四组：①正常对照组，DMEM 培养基培养；②空载质粒对照组，培养基中加入空载质粒；③VEGFR-3 质粒组，加入质粒转染稀释液100 μg，Western blot 检测正常对照组、空载质粒对照组和VEGFR-3 质粒组的VEG FR-3表达量，验证转染成功[11]，实验独立重复3 次；④抑制剂组，转染成功的细胞加入10 μl PI3K/AKT 抑制剂LY294002，培养24 h。

1.2.3 神经球数目、直径检测 各组培养24 h 后，吹打神经球形成单细胞悬液，种植在24 孔板，每组3 个复孔。3 d 后，每组选择4 个视野检测神经球个数，选择15 个神经球测量神经球平均直径，各组重复测量5 次。实验独立重复3 次。

1.2.4 Western blot 检测 PBS 液洗涤3 次，添加细胞裂解液。各组取等量蛋白行SDS-PAGE 电泳，转PVDF 膜，5%脱脂牛奶封闭1 h。配制小鼠一抗VEGFR-3、PI3K、AKT、p-AKT、GAPDH 抗体（浓度分别为1∶1000、1∶200、1∶200、1∶200、1∶1000），一抗4℃孵育过夜；洗涤后，山羊抗小鼠IgG 1∶1000 室温孵育1 h，TBST 液洗涤，压片、照相，Image Pro Plus 7.0 进行图片分析。实验独立重复5 次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CSF-CNs 培养及鉴定

流式细胞分选获得CSF-CNs，用NSE 进行鉴定，见图1。检测标志物PKD2L1 抗体，其纯度为（90.1±1.1）%，确认为CSF-CNs，见图2（封三）。

图2 PKD2L1 免疫荧光鉴定CSF-CNs（n=3）（见内文第24 页）

2.2 转染效果

48 h 的VEGFR-3 质粒转染效率最高，见图3A。与正常对照组、空载质粒对照组比较，VEGFR-3 质粒组VEGFR-3 表达量增加，差异有统计学意义（P ＜0.05），见图3B。

图3 VEGFR-3 质粒转染效果（n=3）

2.3 VEGFR-3 过表达促进CSF-CNs 增殖

正常对照组与空载质粒对照组神经球计数比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；与空载质粒对照组、抑制剂组比较，VEGFR-3 质粒组神经球的计数比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 各组神经球计数比较（，n=3）

表1 各组神经球计数比较（，n=3）

注：与正常对照组比较，aP ＜0.05；与空载质粒对照组比较，bP ＜0.05；与抑制剂组比较，cP ＜0.05。VEGFR-3：血管内皮生长因子受体-3

2.4 各组PI3K、AKT 及p-AKT 表达水平比较

正常对照组与空载质粒对照组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；与空载质粒对照组、抑制剂组比较，VEGFR-3质粒组PI3K、AKT及p-AKT表达升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图4。

图4 各组PI3K、AKT 及p-AKT 蛋白表达水平（n=5）

3 讨论

SCI 可进一步破坏脊髓组织，引起脑脊液变化[12-17]。CSF-CNs 可以与脑脊液、脊髓实质接触，将脊髓实质和脑脊液有效联系在一起，在SCI 修复中有重要作用[18-20]。

本研究利用C57 新生小鼠分离CSF-CNs，将其培养成神经球并观察其增殖情况，验证了CSF-CNs具有神经干细胞属性。此外，本研究还进一步证实CSF-CNs 能特异表达VEGFR-3，并且VEGFR-3 可以通过调控PI3K/AKT 信号通路促进CSF-CNs 增殖。本研究猜测CSF-CNs 在AKT 信号激活后作用于脊髓实质，促进脊髓修复。

VEGFR-3 与特异性配体VEGF-C 结合可激活多种信号[21-22]，诱导细胞增殖[23-25]。其中PI3K/AKT 信号通路介导丝裂原依赖性生长和存活，是重要的信号转导通路，该通路的激活可明显抑制SCI 引起的细胞凋亡[26-28]。

综上所述，在CSF-CNs 中VEGFR-3 可以调控PI3K/AKT 通路促进细胞增殖，LY294002 能阻断该通路抑制CSF-CNs 增殖。